蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法技术

本发明专利技术提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白；其中该微泡包含靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年8月30日提交的美国临时专利申请序列号61/872,115和2013年6月11日提交的美国临时专利申请序列号61/833,880的申请日的优先权，该美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。引言细胞修饰可用于多种不同的应用，包括研究、诊断和治疗应用。使用多种不同的方法，包括将外源核酸和/或蛋白质引入细胞中，可以实现细胞修饰。蛋白质递送——在本领域中被称为蛋白质转导，是将肽或蛋白质基序跨越质膜递送到细胞中的过程。蛋白质递送方法包括显微注射和电穿孔。蛋白质递送方法还包括：通过与基于脂质的试剂形成复合物而进行转染；通过与基于聚合物或肽的试剂形成复合物而进行转染；通过纳入而将肽转导域(PTD)直接添加至感兴趣的蛋白质；病毒样颗粒介导的引入；和外来体介导的蛋白质引入。目前的蛋白质递送方法的一个缺点是为了转染到所需靶细胞中需要产生纯化的蛋白质的贮存物(stock)。用于产生重组蛋白的标准方法可能呈现与溶解度、产率、正确折叠和翻译后修饰相关的问题。这些方法也不允许重组膜蛋白的递送。这些因素中有许多是重要的，因为它们直接涉及待转染的蛋白质的活性。对于直接递送而言，蛋白质的活性具有最高的优先级，以使递送的蛋白质将对细胞产生影响。当前的方法的另一个缺点在于递送本身。由于不利的电荷差异以及低效递送和毒性，基于脂质和聚合物/肽的转染方法具有与蛋白质特异性包装效率相关的问题。电穿孔也已被证明具有与毒性、高水平的不一致性和对递送的蛋白质的量缺乏控制相关的问题。PTD的纳入已知会导致聚集和沉淀，这可能会不利地影响递送效率。最后，在病毒样颗粒(VLP)中递送蛋白质要求使用生成免疫应答的病毒衣壳蛋白进行包装。
技术实现思路
提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。附图简要说明图1提供了如在下面的试验部分描述的制备和使用微泡的示意图。图2A至2D示出了其中产生CRE重组酶微泡的本专利技术实施方案的多个方面并提供了其结果。图3提供了微泡靶蛋白含量的测定的结果。详述提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。在更详细地描述本专利技术之前，应该理解，本专利技术不限于所描述的特定实施方案，因为这当然可以变化。如本领域技术人员所理解的，本专利技术包括各种替代、修改和等同物。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限制。当提供值的范围时，应当理解，本专利技术内包括在该范围的上限和下限之间的各居间值，精确至下限的单位的十分之一(除非上下文清楚地另外指出)，以及在该指定范围内的任何其他指定或居间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且还包括在本专利技术内，服从在所指定的范围内任何具体排除的限值。当指定的范围包括限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本专利技术中。某些范围在本文中以数值前加上术语“约”来呈现。术语“约”在本文中用于对其之后的确切数字以及与该术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其所呈现的上下文中提供该具体列举的数字的基本等效值的数字。应当指出，如在本文中和在所附权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。应进一步指出，可以将权利要求撰写为排除任何可选的元素。这样，此声明旨在用作与权利要求元素的列举相关的排他性术语如“单独”、“仅”等的使用或“否定”限定的使用的在先基础。本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明白，在不偏离本专利技术的范围或精神的情况下，本文描述和说明的各单独实施方案具有分立的组成成分和特征，其可以容易地与任意其他几个实施方案的特征分离或组合。任何描述的方法可以以描述的事件的顺序或在逻辑上可能的任何其他顺序进行。本说明书中引用的任何出版物和专利均通过引用并入本文，如同特定地且单独地指出每个单独的出版物或专利均通过引用而并入，并通过引用而并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是为了其先于申请日的公开内容且不应解释为承认本专利技术由于先前专利技术而没有资格先于此出版物。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地加以确认。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域内普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可以在本专利技术的实施或测试中使用，但现在描述代表性的说明性方法和材料。制备蛋白质富集的微泡的方法如上所概述的，本专利技术的方面包括制备蛋白质富集的微泡的方法。所谓“蛋白质富集的微泡”是指一种促融结构，其在脂双层包膜中包括一定量的一种或多种靶蛋白。如本文所用，术语“促融”是指微泡的以下性质，其提供微泡的膜与靶细胞的膜的融合。因为微泡是促融的，它们能够与靶细胞的脂双层膜融合，从而将其内含物(包括靶蛋白)递送至细胞内。在进一步描述蛋白质富集的微泡之前，现在较详细地综述其制备方法。如上所概述的，本方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持产生微泡的细胞，其中该微泡包含一种或多种靶蛋白。该产生微泡的细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和包含第二二聚化结构域的靶蛋白。包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白在制备微泡的方法中使用的细胞包括具有第一二聚化结构域的膜结合蛋白。该细胞可以包括任何适宜的膜结合蛋白，该膜结合蛋白包括第一二聚化结构域。膜结合蛋白是能够例如经由结合相互作用与微泡的膜稳定地结合的蛋白质，其中该膜结合蛋白当与微泡膜相结合时可以被配置为使得该二聚化结构域与该微泡的胞质溶胶接触。膜结合蛋白可以在大小上不同，在一些情况下范围从5kDa至250kDa，诸如10kDa至100kDa，包括12kDa至50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含靶蛋白的微泡的方法，所述方法包括：在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，所述细胞包含：包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白；和包含第二二聚化结构域的靶蛋白；其中所述微泡包含所述靶蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.11 US 61/833,880;2013.08.30 US 61/872,1151.一种制备包含靶蛋白的微泡的方法，所述方法包括：
在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，所述细胞包含：
包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白；和
包含第二二聚化结构域的靶蛋白；
其中所述微泡包含所述靶蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微泡包含所述膜结合蛋白和所述靶蛋白的
二聚化复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二二聚化结构域在所述二聚化复
合物中彼此特异性结合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此
结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法包括修饰所述微泡中的二聚化介体以
从所述复合物释放靶蛋白。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述细胞进一步包含微泡诱导物。
8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·豪格维茨，托马斯·帕特里克·奎因，安德鲁·艾伦·法默，蒙赛拉·莫雷尔·费尔南德斯，
申请(专利权)人：克隆技术实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US