用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用：利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，并分离得到抗UTY抗原的Fab’片段；制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。本发明专利技术制备得到的UTY抗体纳米颗粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致Y精子凝集，对X、Y精子的分离效率达到80～95％，具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点，且损害极小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家畜快速扩繁领域，具体涉及一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用。
技术介绍
家畜性别控制(性控)一旦能为人类精确掌握，畜牧业的经济效益就会成倍增长。在正常情况下，哺乳动物由携带Y染色体的精子(Y精子)与卵子结合受精，这种受精卵就向雄性发育；而由携带X染色体的精子(X精子)与卵子结合，受精卵即向雌性发育。因此，性的发育方向取决于参加受精的精子类型，人为地选用某一类精子与卵结合受精就可以达到控制家畜性别的目的。常见的性别控制方法有X、Y精子分离法和早期胚胎性别鉴定法。由于早期胚胎性别鉴定法需要从胚胎上取下少量卵裂后的细胞，或多或少会对胚胎造成一定的损伤，会导致受胎率下降，还需要显微操作仪等昂贵的仪器设备和娴熟的显微操作技术，从而制约了该技术的广泛应用；而X、Y精子分离法在受精时就可以人为控制动物的性别，避免了胚胎的后期损伤，操作相对简单，因此只要能分离得到理想的X或Y精子，在生产上有选择性的输精即可控制动物后代的性别。流式细胞仪分离X/Y精子需要昂贵的仪器设备和专业操作人员，并且精液在前期处理时会受到紫外线照射、机械损伤等损害。采用对Y精子具有特异性抗体进行精液分离，由于X、Y精子处在同一液体环境下，极易降低分离效率，同时在常规实验条件下可对X精子产生一定的负面作用，所以提高抗体的特异性，减少其在X精子上的聚集，有望进一步提高X、Y精子分离效率。纳米颗粒是尺寸在1～1000nm的颗粒，纳米颗粒可以将抗体包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全高效的靶向抗体输送。雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)是由Y染色体上的基因编码，在雄性动物细胞中普遍表达(包括Y型精子、胚胎和滋养层细胞)。目前采用细胞毒性T淋巴细胞检测到H-Y抗原有多个抗原表位即抗原肽，这些肽由染色体上一段特异的DNA编码，并从胞内蛋白分离出来，由主要组织相容性复合分子结合呈递在细胞表面。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：1)构建Y精子H-Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基因的编码序列；2)利用步骤1)构建的Y精子H-Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY抗原重组蛋白；3)利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，然后将酶切得到的UTY抗体的抗原结合片段Fab’(即UTY抗体的Fab’片段)进行分离；5)制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。所述目的基因采用反转录PCR扩增得到，扩增的模板为提取自牛或羊的精子中的总RNA。所述扩增采用的引物为：上游引物：5’-CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3’；下游引物：5’-ATCTCGAGAAAGAGGTAATCGTTACA-3’。所述原核表达系统是以Pet-28a质粒与所述目的基因经基于限制性内切酶EcoRI及XhoI的双酶切法构建重组载体并转化宿主细胞而得到。所述步骤4)具体包括以下步骤：将所述单克隆抗体以及胃蛋白酶加入酶切缓冲液中，并于37℃酶切1～2h，所述单克隆抗体与胃蛋白酶的质量比为80～100:l，利用碘乙酸钠终止酶切反应后通过柱层析分离得到UTY抗体的Fab’片段。所述步骤5)具体包括以下步骤：将分离得到的UTY抗体Fab’片段加入磷酸钙纳米颗粒混悬液中，UTY抗体Fab’片段加入的终浓度为80～100μg/mL，然后于20～25℃条件下震荡吸附0.5～1h，再于4～8℃条件下震荡吸附1～2h，得到包含UTY抗体Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。所述磷酸钙纳米颗粒混悬液中的磷酸钙纳米颗粒为针状，粒径大小在50～80nm。上述用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒在牛、羊快速扩繁中的应用。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术利用UTY抗体的Fab’片段与磷酸钙纳米颗粒制备得到UTY抗体靶向纳米颗粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致精液中Y精子凝集，经过离心即可得到高比例的X精子的精液。由于1)：UTY抗体Fab’片段具有相对分子质量小、特异性强和免疫原性低等优点；以及2)：磷酸钙具有生物相容性、生物降解性、可吸收性、无毒廉价等优点。故本专利技术具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点。与现有技术相比，本专利技术制备以及分离的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分离后的精子中X精子的比例达到80～95％，且对分离得到的X精子损害极小。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作详细说明。申请人经过严格对比发现抗原肽UTY在绵羊、山羊和牛上雄性来源的细胞同源性极高，随后将其编码基因作为H-Y抗原的候选基因，该候选基因位于Y染色体的非重组区，仅在雄性组织中表达。因此，实验建立了包裹单克隆抗体的纳米颗粒平台，并将针对Y精子高表达的UTY抗原具有高度特异性的单克隆抗体(anti-UTY)的抗原结合片段Fab’进行分离，然后将其和纳米颗粒交联形成UTY抗原特异性的单克隆抗体纳米颗粒。一.UTY抗体纳米颗粒的制备1.克隆UTY基因由于牛、绵羊和山羊之间UTY基因序列高度保守，其编码区为3319bp，编码1079个氨基酸。因此，设计针对该基因编码区的PCR引物，就可以获得UTY基因的cDNA。同时在设计上下游引物时，添加限制性内切酶EcoRI及XhoI双酶切位点。上游引物为5’-CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3’，下游引物为5’-ATCTCGAGAAAGAGGTAATCGTTACA-3’，引物序列中下划线部分为酶切位点。用RNA提取试剂盒从绵羊(小尾寒羊，宝鸡市麟游县原种羊场，2013年10月)、山羊(关中奶山羊，西北农林科技大学奶山羊场，2013年10月)和牛(中国荷斯坦种公牛，杨凌法斯特奶牛场，2013年10月)的精子细胞中提取RNA，纯化、稀释后(分子克隆实验指南(第4版))进行反转录PCR，将扩增结果进行DNA序列测定。结果发现三种UTY基因序列同源性达98％以上，而氨基酸序列无差异，因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建Y精子H‑Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基因的编码序列；2)利用步骤1)构建的Y精子H‑Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY抗原重组蛋白；3)利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，将酶切得到的UTY抗体的抗原结合片段Fab’进行分离；5)制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，
其特征在于：包括以下步骤：
1)构建Y精子H-Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的
基因为UTY基因的编码序列；
2)利用步骤1)构建的Y精子H-Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY
抗原重组蛋白；
3)利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗
体；
4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，将酶切得到的UTY抗体的
抗原结合片段Fab’进行分离；
5)制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体
纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述目的基因采用反转录PCR扩增得
到，扩增的模板为提取自牛或羊的精子中的总RNA。
3.根据权利要求2所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体
纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述扩增采用的引物为：
上游引物：5’-CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3’；
下游引物：5’-ATCTCGAGAAAGAGGTAATCGTTACA-3’。
4.根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体
纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述原核表达系统是以Pet-28a质粒与

【专利技术属性】
技术研发人员：华松，张涌，付明哲，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61