一种重组猪源抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种重组猪源抗菌肽及其制备方法和应用。重组猪源抗菌肽PR39，其序列如序列表Seq No.1所示。制备方法是：利用基因工程方法人工合成PR39融合基因片段，并在枯草芽孢杆菌中成功表达了重组抗菌肽PR39。进一步研究表明，重组抗菌肽PR39明显抑制革兰氏阴性菌的生长。本抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的小分子多肽，同时还具有许多生物活性例如促进伤口愈合、促进血管生成和降低炎症反应等作用。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术属于农业畜牧兽医应用领域，涉及的是一种重组猪源抗菌肽及其制备方法和应用。
技术介绍
随着抗生素在饲料生产以及动物养殖中的不断应用，许多问题接踵而至，如抗生素添加剂的长期使用导致耐药性病原菌的产生，耐药菌株的出现不仅威胁到了畜牧业，更成为了人类不得不面对的公共卫生危机。因此，人们迫切需要开发一种新型安全的抗菌物质作为饲料添加剂替代抗生素添加到饲料中，从而达到预防动物疾病，促进动物生长，降低饲养成本目的。重组肽PR39是重组表达的一种猪源抗菌肽，含有39个氨基酸残基。它不仅是一种具有广谱抗菌活性的小分子多肽，与此同时还具有许多生物活性例如促进伤口愈合、促进血管生成和降低炎症反应等作用。本研究利用基因工程方法在枯草芽胞杆菌中成功表达了具有广谱抗菌活性的重组抗菌肽PR39，为基因工程方法规模化生产抗菌肽奠定了理论与实践基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪源抗菌肽及其制备方法和应用，是一种具有广谱抗菌活性的重组肽。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种重组猪源抗菌肽PR39，其序列如序列表SeqNo.1所示。本专利技术还具有如下技术特征：1、如上所述的一种重组猪源抗菌肽PR39的制备方法，如下：根据枯草芽孢杆菌的分泌特点以及下游纯化技术特点，在猪源抗菌肽PR39基因上游融合信号肽AmyQ基因，六个组氨酸基因，硫氧还蛋白基因以及肠激酶切位点基因，并在整条基因两端添加酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ。2、如上所述的一种重组猪源抗菌肽PR39，在治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。本专利技术的重组肽PR39是一种重组表达的猪源抗菌肽，它是一种具有广谱抗菌活性的小分子多肽，同时还具有许多生物活性例如促进伤口愈合、促进血管生成和降低炎症反应等作用。其制备方法为基因工程方法规模化生产抗菌肽奠定了理论与实践基础，对建立肽类基因工程菌和抗菌肽研究的共性技术具有重要意义。附图说明图1为目的基因片段酶切鉴定结果图，其中，M：DNA分子量标准；1：空载体质粒；2：重组表达载体质粒；3：重组表达载体EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切结果；4：空载体EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切结果。图2为重组表达载体构建测序结果图。图3为利用Tricine-SDS-PAGE对肠激酶切割融合蛋白的检测结果图，其中，M：蛋白分子量Marker；1：未切割的融合蛋白；2：切割后的融合蛋白。图4为利用Tricine-SDS-PAGE纯化后的PR39的检测结果图，其中，M：蛋白分子量Marker；1和2均为利用阳离子交换柱纯化后的肽。图5为重组抗菌肽PR39的溶血活性分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1目的基因的设计与合成根据枯草芽孢杆菌的分泌特点以及下游纯化技术特点，在猪源抗菌肽PR39基因上游融合信号肽AmyQ基因、六个组氨酸基因、硫氧还蛋白基因以及肠激酶酶切位点基因。具体基因如下所示：GCGGAATTCatgatccaaaaacgtaaacgtacagtttctttccgtcttgttcttatgtgcacacttcttttcgtttctcttcctatcacaaaaacatctgctcgtcgtcgtcctcgtcctccttaccttcctcgtcctcgtcctcctcctttcttccctcctcgtcttcctcctcgtatccctcctggcttccctcctcgtttccctcctcgtttccctGGATCC其中，下划线为限制性内切酶切位点，斜体为肠激酶酶切位点，虚线是组氨酸标签，双下划线为硫氧还蛋白编码基因，加粗大写为终止密码子TAA。上述整条融合基因AmyQ-6×His-Thioredoxin-Enterokinasesite-PR39由上海生工生物技术有限公司合成。实施例2重组表达载体的构建将合成的含有上述目的片段的克隆载体和表达载体pGJ148分别进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，再分别回收目的片段后进行连接。将连接产物利用化学方法转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，提取质粒，采用酶切和测序方法对阳性克隆进行筛选。结果如图1-图2所示。将鉴定正确的阳性质粒命名为pAN39。实施例3目的蛋白的表达及重组抗菌肽PR39的纯化将筛选的阳性克隆接种到LB培养基中进行发酵表达，所得重组抗菌肽PR39利用Ni-NTA亲和层析柱纯化，再进行肠激酶酶切处理后，进行Tricine-SDS-PAGE定性，考马斯亮蓝定量分析以及质谱分析。实施例4抗菌活性的测定利用微量肉汤稀释法测定重组抗菌肽PR39的最小抑菌浓度。利用化学合成的抗菌肽PR39和蜂毒素ME26为对照，验证重组抗菌肽PR39的抑菌效果。以肉汤(MHB)培养基作为稀释液，使用2倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液置于96孔细胞培养板中，每孔100μL。然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。利用化学合成的抗菌肽PR39和蜂毒素ME26为对照，验证重组抗菌肽PR39的抑菌效果。结果如表1所示。重组抗菌肽PR39对革兰氏阴性菌有良好的抑制效果。表1重组抗菌肽PR39的最小抑菌浓度实施例5溶血活性的测定采集鸡的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3遍，再用10mLPBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。结果如图4所示。表明重组抗菌肽PR39无溶血性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组猪源抗菌肽PR39，其特征在于，其序列如序列表Seq No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组猪源抗菌肽PR39，其特征在于，其序列如序列表SeqNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组猪源抗菌肽PR39，其特征在于，制备方法如下：根据
枯草芽孢杆菌的分泌特点以及下游纯化技术特点，在猪源抗菌肽PR39基因上游融合信...

【专利技术属性】
技术研发人员：单安山，王珏，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23