人ADAM15去整合素区域蛋白的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及人ADAM15去整合素区域蛋白的可溶性重组表达及应用。该制备方法包括以下具体步骤：合成ADADM15去整合素区域基因序列；构建pET‑22b‑Sumo‑ADAM15表达载体；培养工程菌；获得重组ADAM15去整合素区域蛋白。本发明专利技术制备得到具有抗肿瘤作用的ADAM15的去整合素区域蛋白，分子量小，利于采用原核系统进行融合表达。通过人ADAM15去整合素结构域基因与Sumo融合，蛋白表达量明显升高，可溶性蛋白的含量大大增加，获得纯度大于95％的人ADAM15去整合素结构域蛋白，并用于抗肿瘤活性研究。且利于获得高表达量的ADAM15去整合素区域，具有良好的市场前景和经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种人ADAM15去整合素区域蛋白的可溶性重组表达及应用。
技术介绍
整合素金属蛋白酶家族蛋白(adisintegrinandmetalloproteinase，ADAM)，是一类锚定于细胞膜表面的跨膜蛋白。ADAM蛋白与蛇毒金属蛋白酶(snakevenommetalloproteinase,SVMP)家族具有很高的同源性，其家族成员具有相似的结构，通常由800-1200个氨基酸组成，含有多个结构域。主要包括：前导域(pro-domain)、类金属蛋白酶功能域(metalloproteinase-likedomain)、去整合素功能域(disintegrin-likedomain)、富含半胱氨酸功能域(cysteine-richdomain)、类表皮生长因子功能域(epidermalgrowthfactor-likedomain)、锚定于细胞膜上的跨膜域(transmembranedomain)和C端的胞质尾区(cytoplasmictaildomain)。ADAM蛋白具有蛋白水解、细胞外基质降解、生物活性因子释放、细胞附着、融合、迁移、信号传导等功能，同时在炎症和肿瘤等病理过程也起重要作用。ADAM15位于人类基因组的lq21.3染色体，由814个氨基酸组成。ADAM15是典型的ADAM家族成员，由信号肽区、前导区、金属蛋白酶区、去整合素区、富含半胱氨酸区、类EGF区、跨膜区及包浆尾段八个区域构成。ADAM15在多种肿瘤中表达上调，其在肿瘤进程中的作用及对抗肿瘤药物研究的指导的作用。ADAM15具有蛋白水解酶活性，其活性主要依赖于在金属蛋白酶结构域中保守的锌离子结合序列HEXGHXXGXXHD。依赖于此金属蛋白酶活性ADAM15可以调控细胞的迁移。同时又有文献报道，ADAM15利用其蛋白水解酶活性可以释放多种跨膜蛋白衍生的EGFR配体，ADAM15的上调可增加配体脱落从而活化表皮生长因子受体从而增强在肿瘤的增殖过程中起到关键的作用的EGFR信号通路的传导而促进细胞的增殖。研究发现，在7种乳腺癌细胞中，ADAM15及E-cadherin的RNA水平都显著提高，ADAM15通过切割E-cadherin响应低血清压力，利用shRNA降低ADAM15的表达后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖与对照组相比明显减慢，提示ADAM15对细胞增殖有积极作用。ADAM15在胃癌细胞中高表达，其抗体可抑制卵巢癌细胞的生长。综上可知，ADAM15在肿瘤中有高表达，降低ADAM15的表达或利用ADAM15的抗体会减慢细胞的增殖，提示ADAM15在肿瘤发展过程中可能起积极促进肿瘤生长作用。ADAM15是ADAM家族中，唯一在去整合素区域含有RGD序列的蛋白。RGD存在于多种细胞外基质中，可与多种整合素结合。ADAM15的去整合素结构域，可以结合于与肿瘤血管新生密切相关的整合素家族(integrin)的粘附分子αvβ3、α5β1、和α9β1，干扰由αvβ3介导的肿瘤细胞对玻璃粘连蛋白的黏附，并减少了该细胞的运动能力。ADAM15的disintegrin-like区域重组表达蛋白在体外以依赖RGD结构的方式与αvβ3特异性相互作用，在体内外均表现出抑制肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移的活性。近年来，重组表达ADAM15的去整合素区域蛋白并研究其活性的工作也广泛开展，重组ADAM15去整合素区域蛋白(rhddADAM15)的功能涉及细胞的粘附、迁移、血管生成细胞间相互作用等方面。天然来源的ADAM15蛋白非常有限，不能满足深入研究的需要。而且，作为含有七个结构域的跨膜糖蛋白，ADAM15结构的特殊性造成了获得具有生物活性的体外重组表达蛋白的困难。因此，获得高产量的ADAM15蛋白是深入研究其抗肿瘤作用机相理的前提，同时也为ADAM15发展成抗肿瘤药物提供可能。大肠杆菌作为基因工程中应用最为广泛的表达系统被用在外源基因的表达，具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、操作简单、可以高效表达多种外源基因的特点，也是目前研究最为深入、发展最完善的表达系统。但是以大肠杆菌为宿主的原核表达系统表达外源蛋白时蛋白常常在细胞质内聚集，形成不可溶的包涵体。为了克服原核表达容易形成包涵体的缺点，人们采用分子伴侣技术，使目的基因与具有协助蛋白质跨膜运输的分子伴侣基因共同表达，以期在细胞所固有的分泌信号肽的帮助下，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，在原核表达系统中高效表达外援蛋白。本申请利用SUMO融合技术在大肠杆菌中重组表达ADAM15去整合素区域蛋白，SUMO标签是一种新型的蛋白标签，已经应用于多种酶、生长因子的表达，SUMO作为融合标签同传统的融合标签相比，不仅能促进蛋白可溶性表达，而且还能促进目的蛋白的正确折叠，并对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性的特点。ADAM15是ADAM家族中，唯一一个在去整合素区域含有RGD序列的蛋白，ADAM15在多种肿瘤中表达上调，其在肿瘤进程中的作用及对抗肿瘤药物指导的作用成为近年来研究热点。天然来源的ADAM15去整合素区域蛋白十分有限，因此获取大量有生物活性的ADAM15去整合素区域蛋白对于研究工作中具有重要意义。ADAM15的去整合素区域蛋白含有15个半胱氨酸，利用大肠杆菌表达可能，形成不可溶的包涵体。本专利技术利用SUMO融合技术在大肠杆菌中重组表达ADAM15去整合素区域蛋白，ADAM15去整合素结构域基因与Sumo融合后，蛋白表达量明显升高，且可溶性蛋白的含量大大增加，和其他蛋白酶不同，本专利技术所采用的Sumo酶是不Sumo标签的三级结构，能够准确的切除标签，不会产生延伸的N-端。本专利技术在Sumo标签连接上6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析纯化，Sumo酶切，获得高纯度的ADAM15去整合素区域蛋白，并进行抗肿瘤活性研究。
技术实现思路
ADAM15的disintegrin-like区域重组表达蛋白在体外以依赖RGD结构的方式与αvβ3特异性相互作用，在体内外均表现出抑制肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移的活性。天然来源的ADAM15去整合素区域蛋白十分有限，因此克隆了人ADAM15的去整合结构域区。编码所述ADAM15去整合素区域蛋白的DNA序列。ADAM15的去整合素区域蛋白含有15个半胱氨酸，利用大肠杆菌表达可能形成不可溶的包涵体。虽然有GST标签等融合表达载体，但是表达产物切割时易产生多余的氨基酸，进而影响到重组蛋白的活性及后续实验研究。因此，本专利技术采用了SUMO表达系统，SUMO蛋白酶对SUMO融合表达系统表达重组蛋白进行切割去掉标签蛋白后，在蛋白的N端不会产生多余的氨基酸，因此是融合表达ADAM15的去整合素区域的最佳表达系统。因此，本专利技术采用SUMO与ADAM15的去整合素区域融合表达，表达后的ADAM15的去整合素区域蛋白以可溶性形式存在，表达后利用SUMO切割去除SUMO蛋白，获得非融合的蛋白分子。本专利技术的目的在于提供一种高效表达、蛋白纯度高、适合大规模生产ADAM15的去整合素区域蛋白的制备方法及其在抗肿瘤作用中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：人ADAM15去整合素区域蛋白的制备方法，特殊之处在于包括以下具体步骤：⑴.合成AD本文档来自技高网...

【技术保护点】
人ADAM15去整合素区域蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：⑴.合成ADADM15去整合素区域基因序列根据GenBank登录的人ADAM15去整合素区域氨基酸序列(AAS72995.1)，依据大肠杆菌偏好密码子对ADAM15去整合素区域碱基序列进行改造，通过PCR法或化学合成法获得编码ADAM15去整合素区域基因序列；⑵.构建pET‑22b‑Sumo‑ADAM15表达载体分别以SUMO和ADAM15的去整合素区域基因序列为模板，设计引物，并通过RCR扩增，得到两段基因序列，再将两段基因序列连接一起，经酶切与表达载体pET‑22b连接，获得重组表达载体pET‑22b‑ADAM15；⑶.培养工程菌将步骤⑵中构建的重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，提取单克隆并接种到培养基中，IPTG诱导表达后进行电泳和免疫印迹操作，通过对培养条件优化，依据SDS‑PAGE分析结果，选取高表达量的工程菌，进行扩大培养；⑷.获得重组ADAM15去整合素区域蛋白诱导表达并收集步骤⑶中的发酵菌体，超声破碎，离心收集上清，通过Ni‑NTA和Sephadex G25进行纯化，得到含有SUMO‑ADAM15的融合蛋白，加入Sumo蛋白酶进行酶切反应，酶切后的融合蛋白进行Ni‑NTA亲和层析，经过洗涤、洗脱、脱盐，得到纯化后的人ADAM15的去整合素区域蛋白。...

【技术特征摘要】
1.人ADAM15去整合素区域蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：⑴.合成ADADM15去整合素区域基因序列根据GenBank登录的人ADAM15去整合素区域氨基酸序列(AAS72995.1)，依据大肠杆菌偏好密码子对ADAM15去整合素区域碱基序列进行改造，通过PCR法或化学合成法获得编码ADAM15去整合素区域基因序列；⑵.构建pET-22b-Sumo-ADAM15表达载体分别以SUMO和ADAM15的去整合素区域基因序列为模板，设计引物，并通过RCR扩增，得到两段基因序列，再将两段基因序列连接一起，经酶切与表达载体pET-22b连接，获得重组表达载体pET-22b-ADAM15；⑶.培养工程菌将步骤⑵中构建的重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，提取单克隆并接种到培养基中，IPTG诱导表达后进行电泳和免疫印迹操作，通过对培养条件优化，依据SDS-PAGE分析结果，选取高表达量的工程菌，进行扩大培养；⑷.获得重组ADAM15去整合素区域蛋白诱导表达并收集步骤⑶中的发酵菌体，超声破碎，离心收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文赫，王会岩，李亚巍，张巍，许娜，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22