基质金属蛋白酶7(MMP‑7)聚集体的单体化方法技术

提供MMP‑7聚集体的单体化方法。MMP‑7的单体化方法，包括用包含低浓度的单价阳离子氯化物(例如氯化钠、氯化钾等)的缓冲溶液或用不包含单价阳离子氯化物的所述缓冲溶液处理MMP‑7聚集体。包括所述单体化方法的MMP‑7的制备方法，和包含溶解于所述缓冲溶液的MMP‑7的(药物)组合物。当制备包含低浓度的MMP‑7的(药物)组合物时，使用添加有糖醇或糖的所述缓冲溶液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使基质金属蛋白酶7(以下也称为“MMP-7”)的聚集体单体化的方法。具体地，本专利技术涉及MMP-7聚集体的单体化方法，其包括用包含低浓度的单价阳离子化合物的溶液或不包含所述化合物的该溶液处理MMP-7聚集体；MMP-7的制备方法，其包括所述MMP-7聚集体的单体化方法；和在上述溶液中包含MMP-7的(药物)组合物，在所述溶液中还溶解有糖醇或糖。
技术介绍
MMP-7是属于在活性位点具有锌分子的锌金属蛋白酶家族的基质金属蛋白酶(以下也称为“MMP”)之一(参见例如非专利文献1)。MMP作为前体产生，其信号序列在细胞外分泌后被加工，然后加工前序列以产生活性形式。细胞外分泌的MMP控制细胞外基质的代谢。另一方面，据报道MMP-7主要从癌细胞分泌并参与侵袭和转移(参见例如非专利文献2)。与其他MMP相比，MMP-7缺乏在许多其它MMP中共有的铰链区和血红素蛋白样结构域，由最小分子单位组成。MMP-7的底物是构成胶原或细胞外基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖)的组分。MMP-7被认为参与存在于(脊柱)硬膜外腔中的髓核的自发性缓解，因为MMP-7的底物是作为软骨组织的主要成分的聚集蛋白聚糖，且来自椎间盘移位手术的标本的巨噬细胞表达MMP-7(参见例如非专利文献3)。此后，Haro等人将MMP-7施用于疝狗的椎间盘，并观察到椎间盘内的髓核体积的减少，从而显示MMP-7作为治疗椎间盘移位的药物的可能性(参见例如非专利文献4)。需要开发MMP-7作为药物。然而，MMP-7仅以痕量存在于活体中，因此从活体中分离和纯化MMP-7是极其困难的。此外，当使用来自活体的组分时，考虑到安全性，例如潜在的病毒感染，存在担心。尽管MMP-7可以从癌细胞获得，但是不优选使用癌细胞作为生产来源(参见例如非专利文献5)。为了解决这些问题，已经尝试通过重组DNA技术获得MMP-7。Barnett等人报道了MMP-7在CHO细胞中表达(参见例如非专利文献6)；据报道，通过使用通过将碱性磷酸酶的信号序列的核苷酸序列与基质金属蛋白酶7原(以下也称为“proMMP-7”)的基因序列连接而产生的对于大肠杆菌的密码子使用优化的核酸片段，可溶性proMMP-7在34℃下表达，不溶性proMMP-7在42℃下表达(参见例如专利文献1)；和据报道，通过使用通过将修饰的信号肽连接至proMMP-7的基因片段而产生的核酸片段，proMMP-7作为包涵体大量表达(参见例如专利文献2)。为了将proMMP-7转化为活性MMP-7，据报道在1mM(4-氨基苯基)乙酸汞(APMA)或0.2μM胰蛋白酶的存在下在37℃加热proMMP-7，或在53℃加热含有前MMP的溶液(参见例如非专利文献7)。他们揭示，在低浓度(小于1mg/ml)的活化的MMP-7(也称为基质溶解素(Matrilysin))在-20℃下储存6个月和在室温下储存28天后，在其活性和电泳行为方面没有变化。虽然没有关于变化的确定描述，但是他们似乎暗示从电泳结果没有观察到基质溶解素的分解。除此之外，有关于proMMP-7和MMP-7的纯化的各种报告，例如Kihira和Oneda等人(参见例如专利文献1、非专利文献8)，因此在实验水平上已经建立了一定程度的MMP-7的纯化方法。通常，在实验水平上纯化MMP-7的方法被放大用于大规模生产。然而，还没有建立大量制备MMP-7的方法。几乎没有关于在大量制备MMP-7中的问题及其解决方案的报道。对于包含MMP-7的组合物，报道了包含三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris盐酸盐)、氯化钙和氯化钠的组合物(参见例如专利文献3至5，非专利文献7、9)。已知在溶液组合物的状态下，金属蛋白酶如MMP-7在氯化钙和氯化钠共存下稳定(参见例如专利文献6)。特别是，考虑到安全性，药物通常需要具有大约体液的渗透压。氯化钠通常用作液体组合物的渗透压调节剂。作为实际情况，在这些文献中公开的大多数组合物包含单价阳离子化合物，例如氯化钠，其浓度与体液的浓度等渗或大于体液的浓度。此外，这些文献中公开的组合物不包含糖醇或糖。专利文献专利文献1：日本专利2938352专利文献2：WO2010/047347A1专利文献3：JP2000-344672专利文献4：JP2000-226329专利文献5：JP2002-173424专利文献6：JP2005-6509非专利文献非专利文献1:Soler等,BiochemBiophysResCommun,1994,vol.201,p.917-923非专利文献2:Ii等,ExpBiolMed(Maywood),2006,vol.231,p.20-27非专利文献3:Haro等,JSpinalDisord,1999,vol.13,p.245-249非专利文献4:Haro等,JOrthopRes,2005,vol.23,p.412-419非专利文献5:Miyazaki等,CancerResearch,1990,vol.50,p.7758-7764非专利文献6:Barnett等,ProteinExpPurif,1994,vol.5,p.27-36非专利文献7:Crabbe等,Biochemistry,1992,vol.31,p.8500-8507非专利文献8:Oneda等,JBiochem,1999,vol.126,p.905-911非专利文献9:Browner等,Biochemistry,1995,vol.34,p.6602-6610。
技术实现思路
(专利技术要解决的技术问题)在开发包含MMP-7的药物的过程中，本专利技术人已发现，在单价阳离子化合物例如氯化钠为150mM或更高(其与体液等渗)的情况下，如在常规药物产品、特别是如上所述的金属蛋白酶的液体组合物的情况下，MMP-7形成聚集体，并且MMP-7被吸附至在通常用于制备蛋白质或其制剂的装置中的凝胶，或通常用于储存制剂的容器，例如小瓶。因此，问题在于提供一种MMP-7聚集体的单体化方法，其中在制备MMP-7时抑制MMP-7至制备装置的吸附；一种MMP-7的制备方法，其包括所述MMP-7聚集体的单体化方法；和包含MMP-7的(药物)组合物，其中MMP-7的聚集体形成和吸附被抑制。(解决问题的手段)本专利技术人为了解决上述问题进行了认真的研究，结果发现了以下(1)至(4)以完成本专利技术。(1)通过用包含低浓度的单价阳离子氯化物(氯化钠和氯化钾)的溶液例如Tris缓冲液(pH6至8)处理，使MMP-7聚集体解离以形成单体。此外，当用不包含单价阳离子氯化物的该溶液处理MMP-7聚集体时，它们同样形成单体。(2)通过将用上述处理MMP-7聚集体的单体化方法(以下也简称为“单体化方法”)引入到MMP-7的制备过程中，可以提高生产MMP-7的效率。特别地，通过在将proMMP-7通过自活化转化为MMP-7后立即将单体化方法引入用超滤膜处理的过程中，可以获得更显著的效果。(3)MMP-7单体维持高酶活性。(4)通过向如上所述的Tris缓冲液中添加糖或糖醇，如甘露糖醇和蔗糖，不仅抑制MMP-7聚集体的形成，而且抑制MMP-7至凝胶和小瓶壁的吸附。即，通过制备包含当制成水溶液时浓度为约150mM(其与体液等渗)或更低的本文档来自技高网...

【技术保护点】
基质金属蛋白酶7(MMP‑7)聚集体的单体化方法，所述方法包括用包含130 mM或更低的单价阳离子化合物的溶液或用不包含单价阳离子化合物的溶液处理MMP‑7聚集体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.21 JP 2014-1054521.基质金属蛋白酶7(MMP-7)聚集体的单体化方法，所述方法包括用包含130mM或更低的单价阳离子化合物的溶液或用不包含单价阳离子化合物的溶液处理MMP-7聚集体。2.根据权利要求1的单体化方法，其中用包含130mM或更低的单价阳离子化合物的溶液处理所述MMP-7聚集体。3.根据权利要求1的单体化方法，其中用不包含单价阳离子化合物的溶液处理所述MMP-7聚集体。4.根据权利要求1或2的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物是100mM或更低。5.根据权利要求1、2或4的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物是80mM或更低。6.根据权利要求1、2、4或5的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物是40mM或更低。7.根据权利要求1、2、4、5或6的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠和磷酸钾。8.根据权利要求1、2、4、5或6的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物来自单价阳离子氯化物。9.根据权利要求8的单体化方法，其中所述单价阳离子化合物选自氯化钠和氯化钾。10.根据权利要求1-9中任一项的单体化方法，其中所述溶液还包含氯化钙。11.根据权利要求10的单体化方法，其中所述氯化钙是30mM或更低。12.根据权利要求1-11中任一项的单体化方法，其中所述溶液是缓冲溶液。13.根据权利要求12的单体化方法，其中所述缓冲溶液是5-25mMTris缓冲液。14.根据权利要求1-13中任一项的单体化方法，其中所述MMP-7是20mg/ml或更低。15.根据权利要求13或14的单体化方法，其中所述溶液是包含30-40mM氯化钠和5-30mM氯化钙的5-25mMTris缓冲液(pH6-8)。16.根据权利要求1-15中任一项的单体化方法，其中所述溶液还包含糖醇和/或糖。17.根据权利要求16的单体化方法，其中所述糖醇和/或糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇和寡糖醇。18.根据权利要求16或17的单体化方法，其中所述糖醇和/或糖是2%或更高。19.根据权利要求18的单体化方法，其中所述糖醇和/或糖是2-7%。20.根据权利要求17-19中任一项的单体化方法，其中所述糖醇和/或糖是甘露糖醇或蔗糖。21.根据权利要求20的单体化方法，其中所述甘露糖醇是2-5%和所述蔗糖是2-7%。22.MMP-7的制备方法，所述方法包括由权利要求1-21中任一项所述的单体化方法组成的步骤。23.权利要求22的制备方法，其中所述步骤在使用包含130mM或更高的单价阳离子化合物的溶液处理的步骤后进行。24.权利要求22或23的制备方法，其中所述方法包括以下步骤(1)-(5)：(1)破裂产生proMMP-7包涵体的细胞的步骤；(2)溶解/重折叠处理proMMP-7包涵体的步骤；(3)纯化proMMP-7的步骤；(4)proMMP-7自活化成MMP-7的步骤；和(5)由权利要求1-21...

【专利技术属性】
技术研发人员：中武博，平岛正树，竹尾英树，松山玲子，森河亘，
申请(专利权)人：一般财团法人化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP