三型金属蛋白酶(TIMP-3)组织抑制剂的变体、组合物和方法技术

本发明专利技术公开TIMP-3突变蛋白、变体和衍生物，编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请主张2013年3月14日提交的美国临时申请号61/782,613；2013年3月15日提交的美国临时申请号61/798,160；2013年3月18日提交的美国临时申请号61/802,988和2014年2月17日提交的美国临时申请号61/940,673的权益，将所述申请以引用的方式整体并入本文。对序列表的引用本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表作为2014年3月11日创建的标题为A-1827WOPCT_SL31314的文件提供，其大小是306KB。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。专利
本专利技术一般涉及金属蛋白酶抑制剂。具体来讲，本专利技术涉及金属蛋白酶3（“TIMP-3”)的组织抑制剂和新颖、有用的变体、突变蛋白及其衍生物。专利技术背景结缔组织和关节软骨通过胞外基质合成和降解的相对作用维持动态平衡。基质降解主要是通过金属蛋白酶的酶促作用造成的，包括基质金属蛋白酶(MMP)和具有凝血栓蛋白基序的去整合素-金属蛋白酶(ADAMTS)。虽然这些酶在许多自然过程(包括发育、形态形成、骨重塑、创伤愈合和血管生成)中是重要的，但是导致酶水平升高的这些酶的失调被认为在结缔组织降解性疾病(包括类风湿性关节炎和骨关节炎)中以及在癌症和心血管病状中发挥不利作用。金属蛋白酶的内源性抑制剂包括血浆α2-巨球蛋白和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)，其中有四种已知在人类基因组中编码。TIMP-3抑制所有主要的软骨降解金属蛋白酶，有多重证明表明它保护软骨。向软骨外植体添加所述蛋白质预防细胞因子诱导的降解，并且关节内注射减少骨关节炎大鼠内侧半月板损伤模型中的软骨损伤。MMP的失调还出现充血性心力衰竭中并且被认为在众多促炎症反应过程中发挥作用。然而，作为MMP活性的治疗抑制剂开发TIMP-3已经受到重组蛋白质生产以及TIMP-3重组形式半衰期短的挑战所阻碍。因此，本领域需要显示良好的生产、纯化和药动学/药效学性质的形式的TIMP-3。附图简述图1呈现天然的全长人TIMP-3和突变形式的全长人TIMP-3的比对，其中字母“X”已经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列有下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。图2呈现天然的全长人TIMP-3，和某些氨基酸置换已经完成的TIMP-3变体的比对。呈现信号序列并且对于天然的全长TIMP-3序列加以下划线以保持编号的一致性；其他信号序列可以因此置换，如本文所述。图3呈现二维多肽图像，其中氨基酸经排列以确定包含TIMP-3的N-结构域(残基23-143)和C-结构域(144-211)的那些残基、以及形成二硫键的半胱氨酸位置。图4呈现天然的人N末端TIMP3和突变形式的人N末端TIMP3的比对，其中字母“X”已经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加以下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。设想在成熟形式的N末端TIMP-3中的某些置换，并且在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，且“m”表示已被置换的氨基酸(“-”表示氨基酸已缺失)。因此，例如，“K45I”指示在氨基酸45处的赖氨酸(K)已被异亮氨酸(I)置换。M67缺失通过M67-表示。用一对甘氨酸置换残基71-77通过Y70-GG-H78表示。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括以下突变(单独或组合)：R43F、K45I、K45T、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T、K68I、Y70-GG-H78、H78W。突变的特定组合包括K45I、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T；K45I、K53T、E54Y、M67-、K68I；K45I、K53T、K65T、M67-、K68T；K45I、K53T、M67-、K68I；K45I、K53T、M67-、K68I、H78W；K45I、K65T、K68I；K45I、K65T、M67-、K68T；K45I、K65T、M67-、K68T、H78W；K45I、M67-、K68I、H78W；K45I、M67-、K68T；K45T、K65T、M67-、K68I；K45T、K65T、M67-、K68T；K53T、E54Y；K53T、H78W；R43F、K45I、K65T、K68I。图5呈现天然的人N末端TlMP3和突变形式的人N末端TIMP3的比对，其中字母“X”已被置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加以下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。设想在N末端TIMP-3的成熟形式中的某些置换，并且在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，且“m”表示已被置换的氨基酸（“-”表示氨基酸已缺失)。因此，例如，“K45E”指示在氨基酸45处的赖氨酸(K)已被谷氨酰胺(E)置换。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括以下突变(单独或组合)：T25G；T25H；T25K；T25P；T25R；T25S；T25W；C26A；S27V；S27A；P28A；P28D；P28L；P28S；S29I；H30A；P31A；Q32A；F35A；C36A；N37A；D39A；V41A；142A；R43A；R43E；R43T；K45E；V46A；G48A；G48S；K49S；K49E；L51E；L51T；K53D；E54S；P56N；L60I；V61Q；T63E；T74E；H78D；H78E；Q80E；G116T；C118A；N119D；C143A；和144N-。特定的突变组合包括：S27VS29I；V46AG48SK49EL51EK53DE54SP56NL60IV61QG116TN119D；C26AC118A；C36AC143A；K45EK49E；K45EK49S；K45EQ80E；K45ET63E；K45ET63EH78E；K45ET63EH78EQ80E；L5lTT74EH78D；R43ET74EH78DQ80E；R43TT74EH78DQ80E；T63EH78D；T63EH78E；T63EH78EQ80E；T63ET74EH78D；T63ET74EH78E；T74EH78DQ80E；T74EH78EQ80E；Y70-GG-78H。图6呈现天然TIMP-2和天然TIMP-3的比对。相应残基中的氨基酸的同一性由序列下面的星号标明。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQIDNO：2中所示的TIMP-3的成熟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离TIMP‑3突变蛋白，所述突变蛋白具有在氨基酸序列方面与SEQ ID NO:2中所示的TIMP‑3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，具有至少一个突变，所述突变选自由以下组成的组：K45E；K45N；K45S；V47T；K49N；K49E；K49S；K50N；L51T；L51N；V52T；K53T；P56N；F57N；G58T；T63E；T63N；K65T；K65N；M67T；K68S；T74E；K75N；P77T；H78D；H78E；H78N；Q80E；Q80T；K94N；E96T；E96N；V97N；N98T；K99T；D110N；K112T；Q126N；K133S；R138T；R138N；H140T；T158N；K160T；T166N；M168T；G173T；H181N；A183T；R186N；R186Q、R186E、K188T；K188Q、K188E、P201N；K203T；I205F、I205Y、A208G、A208V和A208Y。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 61/782613;2013.03.15 US 61/798160;201.一种分离TIMP-3突变蛋白，所述突变蛋白具有在氨基酸序列方面与SEQIDNO:2中
所示的TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，具有至少一个突变，所述突变选自由以
下组成的组：K45E；K45N；K45S；V47T；K49N；K49E；K49S；K50N；L51T；L51N；V52T；K53T；P56N；
F57N；G58T；T63E；T63N；K65T；K65N；M67T；K68S；T74E；K75N；P77T；H78D；H78E；H78N；Q80E；
Q80T；K94N；E96T；E96N；V97N；N98T；K99T；D110N；K112T；Q126N；K133S；R138T；R138N；H140T；
T158N；K160T；T166N；M168T；G173T；H181N；A183T；R186N；R186Q、R186E、K188T；K188Q、
K188E、P201N；K203T；I205F、I205Y、A208G、A208V和A208Y。
2.一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQIDNO:2中所示的
TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，具有突变F57N和至少一个其他突变，其中所述
突变是在TIMP-3的一个或多个K残基处的置换。
3.如权利要求2所述的TIMP-3突变蛋白，其中所述其他突变向所述氨基酸序列中引入
N-连接的糖基化位点。
4.一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQIDNO:2中所示的
TIMP-3的成熟区有至少90%同一性的成熟区，其中所述突变蛋白具有至少一个向所述氨基
酸序列中引入至少一个N-连接的糖基化位点的突变。
5.如权利要求4所述的TIMP-3突变蛋白，其中引入两个、三个、四个、五个或六个N-连接
的糖基化位点。
6.如权利要求3所述的TIMP-3突变蛋白，其中所述N-连接的糖基化位点是在选自由以
下组成的组的所述TIMP-3氨基酸序列的区域引入的：包含氨基酸48-54的区域；包含氨基酸
93-100的区域；包含氨基酸121-125的区域；包含氨基酸143-152的区域；氨基酸156-164；包
含氨基酸183-191的区域；及其组合。
7.如权利要求6所述的TIMP-3突变蛋白，其中引入两个、三个、四个或五个或六个(或更
多)N-连接的糖基化位点。
8.一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQIDNO:2中所示的
TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，其中所述突变蛋白具有至少一个选自由以下
组成的组的突变：
(a)TIMP-3表面暴露的带正电膜片中的一个或多个突变，其导致模拟TIMP-1、TIMP-2
或TIMP-4带电表面的TIMP-3带电膜片的特征的改变；
(b)一个或多个降低对蛋白水解裂解敏感度的突变；
(c)一个或多个导致TIMP-3突变蛋白与清除受体LRP-1相互作用降低的突变；
(d)一个或多个导致TIMP-3突变蛋白肝素或胞外基质组分的相互作用降低的突变；
(e)向天然TIMP-3序列添加一个或多个半胱氨酰残基；
(f)改善的药动学和/或药效学性质；
(g)引入至少一个N-连接的糖基化位点的一个或多个突变；和
(h)(a)-(g)中所示的突变的组合。
9.如权利要求8所述的TIMP-3突变蛋白，其选自由以下组成的组：
i.K45E、K49S；(SEQIDNO:5)
ii.K45E、K49E；(SEQIDNO:6)
iii.K45E、T63E；(SEQIDNO:7)
iv.K45E、Q80E；(SEQIDNO:8)
v.K45E、T63E、H78E；(SEQIDNO:10)
vi.T63E、H78E、Q80E；(SEQIDNO:11)
vii.K45E、T63E、H78E、Q80E；(SEQIDNO:12)
viii.T63E、T74E、H78E；(SEQIDNO:13)
ix.T63E、T74E、H78D；(SEQIDNO:14)
x.L51T、T74E、H78D；(SEQIDNO:53)
xi.T74E、H78E、Q80E；(SEQIDNO:16)
xii.T74E、H78D、Q80E；(SEQIDNO:17)
xiii.K45N、V47T；(SEQIDNO:26)
xiv.K65N、M67T；(SEQIDNO:37)
xv.K45N、V47T、T63E、T74E、H78E；(SEQIDNO:18)
xvi.K49N、L51T、T63E、T74E、H78E；(SEQIDNO:19)
xvii.K45E、K49N、L51T、T63E；(SEQIDNO:20)
xviii.K49N、L51T、T74E、H78E；(SEQIDNO:21)
xix.K49N、L51T；(SEQIDNO:27)
xx.K50N、V52T；(SEQIDNO:30)
xxi.L51N、K53T；(SEQIDNO:54)
xxii.F57N；(SEQIDNO:33)
xxiii.P56N、G58T；(SEQIDNO:31)
xxiv.T63N、K65T；(SEQIDNO:36)
xxv.P56N、G58T、T63N、K65T；(SEQIDNO:32)
xxvi.K75N、P77T；(SEQIDNO:38)
xxvii.H78N、Q80T；(SEQIDNO:39)
xxviii.K94N、E96T；(SEQIDNO:40)
xxix.E96N、N98T；(SEQIDNO:41)
xxx.V97N、K99T；(SEQIDNO:42)
xxxi.D110N、K112T；(SEQIDNO:43)
xxxii.Q126N；(SEQIDNO:44)
xxxiii.R138N、H140T；(SEQIDNO:46)
xxxiv.R138T；(SEQIDNO:45)
xxxv.T158N、K160T；(SEQIDNO:47)
xxxvi.T166N、M168T；(SEQIDNO:48)
xxxvii.G173T；(SEQIDNO:49)
xxxviii.H181N、A183T；(SEQIDNO:50)
xxxix.R186N、K188T；(SEQIDNO:51)
xl.P201N、K203T；(SEQIDNO:52)
xli.A208Y；(SEQIDNO:55)
xlii.A208V；(SEQIDNO:56)
xliii.K45S、F57N；(SEQIDNO:23)
xliv.K49S、F57N；(SEQIDNO:28)
xlv.K68S、F57N；(SEQIDNO:34)
xlvi.K133S、F57N；(SEQIDNO:35)
xlvii.K45S、K133S、F57N；(SEQIDNO:24)
xlviii.K49S、K68S、F57N(SEQIDNO:29).
xlix.K45S、F57N、I205F、A208G(SEQIDNO:57)
l.K45S、F57N、A208G(SEQIDNO:58)
li.K45S、F57N、I205Y(SEQIDNO:59)
lii.K45S、F57N、I205Y、A208G(SEQIDNO:60)
liii.K45N、V47T、F57N、K75N、P77T、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO:61)
liv.K45N、V47T、F57N、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO62):
lv.K45N、V47T、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T(SEQIDNO:63)
lvi.K45S、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R186N、K188T(SEQIDNO:64)
lvii.K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、G173T(SEQIDNO:65)
lviii.K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、G173T(SEQIDNO:66)
lix.K45N、V47T、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R138T、R186N、K188T(SEQIDNO:67)
lx.K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、Q126N、R138T(SEQIDNO:68)
lxi.K45N、V47T、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R186N、K188T(SEQIDNO:69)
lxii.K45N、V47T、K50N、V52T、V97N、K99T、R138T、R186N、K188T(SEQIDNO:70)
lxiii.K45S、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO:71)
lxiv.K45S、F57N、K75N、P77T、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO:72)
lxv.K45N、V47T、K50N、V52T、V97N、K99T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:73)
lxvi.K45E、F57N、Q126N、R138T、G173T(SEQIDNO:74)
lxvii.K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO:75)
lxviii.K45S、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R138T、R186N、K188T(SEQIDNO:76)
lxix.K45S、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:77)
lxx.K45N、V47T、F57N、K94N、E96T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:78)
lxxi.K45N、V47T、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186N、K188T(SEQIDNO:79)
lxxii.K45N、V47T、F57N、V97N、K99T、R138T、G173T(SEQIDNO:80)
lxxiii.K45N、V47T、F57N、K99EG173T、R186N、K188T(SEQIDNO:81)
lxxiv.K45E、K49E、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:
82)
lxxv.K50N、V52T、K94N、E96T、R138T、G173T(SEQIDNO:83)
lxxvi.K45E、K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、G173T(SEQIDNO:84)
lxxvii.K50N、V52T、K94N、E96T、R138T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:85)
lxxviii.K45E、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、G173T、R186N、K188T(SEQIDNO:86)
lxxix.K45N、V47T、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186Q、K188Q(SEQIDNO:
87)
lxxx.K45SF57NK94N、E96TR138TG173T(SEQIDNO:88)
lxxxi.K45EF57NK94N、E96TR138TG173T(SEQIDNO:89)
lxxxii.K45EF57NK94N、E96TD110N、K112TR138TG173T(SEQIDNO:90)
lxxxiii.K45EF57NK94N、E96TR138TG173TR186Q、K188Q(SEQIDNO:91)
lxxxiv.K45EF57NK94N、E96TR138TG173TR186E(SEQIDNO:92)
lxxxv.K45EF57NK94N、E96TR138TG173TK188E(SEQIDNO:93)
lxxxvi.K45EF57NK94N、E96TR138TG173TR186N、K188T(SEQIDNO:94)
lxxxvii.K45EK50N、V52TK94N、E96TD110N、K112TR138TG173T(SEQIDNO:95)
lxxxviii.K45EK50N、V52TK94N、E96TR138TG173TK188E(SEQIDNO:96)
lxxxix.K50N、V52TF57NK94N、E96TR138TG173T(SEQIDNO:97)
xc.K50N、V52TF57NK94N、E96TD110N、K112TR138T(SEQIDNO:98)和
xci.K45EF57NK94N、E96TD110N、K112TR138T(SEQIDNO:99)。
10.如权利要求8所述的TIMP-3突变蛋白，其选自由以下组成的组：K49E、K50E、K53E、
K99E、R186Q、K188Q；K49S、K50N/V52T、K53E、V97N/K99T、R186N/K188T；K50N/V52T、V97N/
K99T、R186N/K188T；K49E、K53E、K188Q；K50N/V52T、R186N/K188T；K50N/V52T、F57N、R186N/
K188T；K45S...

【专利技术属性】
技术研发人员：J孙，JC奥奈尔，RR克彻姆，RI赫希特，EJ贝罗斯基，ML迈克尔斯，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：美国;US