本发明专利技术设计遗传编码的基于FRET的生物传感器以监测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性。MMP-9是在生理学和病理学过程中涉及的在细胞外起作用的内肽酶。锚定于膜上的遗传编码的FRET生物传感器使得在细胞上MMP-9作用的精确区域以高时空分辨率研究MMP-9的蛋白裂解活性。所述生物传感器在活细胞中的体外和体内的应用性已经通过纯化的MMP-9自激活突变体对生物传感器的裂解进行比率分析得到证明。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器及其用途 本专利技术涉及遗传编码的基于FRET的基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性生物传感器及 其用途。 现有技术 在阐明控制基础细胞功能的机制方面的进展使研究者们的关注目标转移到细胞 动力学上，并产生对灵敏且足够快速地追踪活细胞中动态进程的方法的需求不断增长。在 大分子相互作用的亚细胞时空定位领域，基于福斯特共振能量转移（F&rS.ter Resonance Energy Transfer，FRET)的方法尤其有用。 近来，已经开发了大量的不同的遗传编码的基于FRET的生物传感器。其可用于研 究不同的现象如离子浓度， 有机化合物浓度，GTPase活性，蛋白质磷 酸化以及细胞内的机械应力。其优势是在活 细胞和生物体中实时追踪这些现象的能力。 MMP-9是一种细胞外分泌的92kDa的蛋白酶，属于锌钙依赖的内肽酶家族。其裂解 大量的细胞外基质蛋白质和细胞粘附分子。大量研究表明MMP-9通过其在调控血管生成与 裂解细胞外基质而使肿瘤进入转移的双重作用在癌症发展中起显著作用。在大量不同肿瘤中 都观察到MMP-9表达相比于健康受试者的增加，其中肿瘤侵袭性与MMP-9活性水平之间有明 显的正向联系。细胞外基质的MMP-9加工 还可导致促进血管生成的细胞因子和生长因子的释放。事实上，研究指出，MMP-9活性水平是癌症中可能的预后因素（见 Klein，等人，2004的综述）。 目前的研究还指出，MMP-9是突触可塑性以及延伸到被认为依赖于突触可塑性的 过程--学习和记忆中的关键调控因子之一。突触可塑性是大脑中突触之间联接强度改变 的能力。 通常运用的检测MMP-9蛋白裂解活性的方法如DQ-明胶(一种大量标记有荧光素的 明胶衍生物，其完整时荧光素几乎完全淬灭一一明胶酶活性导致荧光增加)或凝胶/原位酶 谱法并不能对明胶酶活性的定位进行高时空分辨率的评估。此外，其都是基于明胶的并且 检测基质金属蛋白酶明胶酶亚家族的另一个成员丽P_2(连同MMP-9)的活性。由于丽P-2表 达水平远远高于MMP-9,所以这些方法检测出的主要裂解都来自MMP-2的蛋白裂解活性而非 MMP-9。其他近期产生的荧光丽P-9活性生物传感器是完全合成的，因此其 预期是以类似DQ-明胶的方式使用的。 DQ-蛋白质(染料淬灭)底物是市售可得的广泛使用的MMP-9活性探针。DQ底物是用 荧光染料过量标记的天然底物的类似物。所述过量标记形成的染料分子紧邻位置是对完整 底物的荧光信号进行淬灭的原因。MMP-9对DQ底物的水解导致染料分子的分离及荧光信号 的增加。DQ-明胶和IV型DQ-胶原已经成功用于在凝胶和原位酶谱上以及在活细胞显微成像 中体外检测蛋白酶活性（明胶酶活性测定试验）（见Cavallo-Medved等人，2009和Sameni等 人，2009) AQ-明胶和IV型DQ-胶原使得能够在活细胞中ECM降解及细胞内降解过程的追踪 可视化。然而，由于鉴别负责降解的蛋白酶和含有这些蛋白酶及降解产物的细胞分区需要 其他技术，这是其用途的限制。即使与活细胞成像联合使用，DQ底物至多只能提供对蛋白裂 解活性的总体测量(global measure)。由于DQ-蛋白质底物受到多种蛋白酶裂解，在局部使 用的用途不大，又需要考虑到超结构形态学变化，且DQ-蛋白质底物不适于体内成像，因此 其不能促进未来对MMP-9基础生理学和病理学功能的研究。 因此，设计出大量新分子探针以解决DQ-蛋白质底物的不足。由于MMP有可能成为 癌症的预后标记物，因此在用于检测MMP-9蛋白裂解活性的诊断和分析探针领域做了大量 工作（见RoopaliRoy等人，2011，其调查了几种MMP-9活性探针及其用作检测癌症的诊断工 具的适宜性，以及Scherer等人，2008,其综述了癌症中MMP活性检测领域中近期发展）。近红 外或NIRF探针引起了人们极大的兴趣，因为对近红外光的躯体通透性并因此有可能用于体 内，尽管也开发了正电子发射断层扫描探针。大量NIRF探针显示出自淬灭特性，以增加信噪 比。一种2009年开发并起初意欲用于检测MMP-2活性的称为Cy5.5-C6的环肽NIRF探针 被成功用于关联结直肠癌进展与MMP-2和MMP-9水平。 该探针的独特属性是其结合于MMP-9并抑制其活性。市售可得的MMPSen Se680是另一种用于 在体内检测MMP-9的NIRF探针，但在蛋白 酶特异性方面，探针自身相当难以区分，其可被MMP-2、-3、-9和-13裂解。最后，研究者通过 对携带移植瘤小鼠注射自组装的三螺旋近红外探针(探讨于Akers等人，2012)观察到注射 24小时后肿瘤相关的荧光有强烈（五倍)增加。在施用GM6001光谱金属蛋白酶抑制剂后，荧 光则消除。 尽管上文描述的NIRF探针相对DQ-蛋白质底物有明显的进步，但是其在设计理念 上用途都狭窄不少一一只是作为诊断工具而非研究工具使用。加上其中一些显示出低的蛋 白酶特异性，另一些有不期望的MMP抑制特性，且依赖于合成荧色物，很明显其不适合于在 细胞超结构水平(质膜结构域，树突棘，等等)上对MMP-9进行定位。 Fudala等人，2011和Fudala等人，2012,描述的MMP-9活性探针通过利用人工MMP-9 裂解位点解决了低蛋白酶特异性的问题。该分析探针由两种荧光染料(5-FAM和Cy5)构成， 二者被可由丽P-9裂解的短肽分隔开。在完整的探针中，FRET引起5-FAM荧光的淬灭，而Cy5 荧光得到强烈增强。MMP_9(而非MMP-2)的裂解导致荧色物的分离且5-FAM荧光的显著增加。 尽管Fudala等人开发的MMP-9活性探针更可能在将来以聪明的方式使用（如DQ-蛋白质底物 的例子），然而其具有和NIRF探针相同的缺点，这使之不能用于研究生理学和病理学条件下 的MMP-9的基础功能。 了解MMP-9在生理学（细胞外基质重塑、血管生成、突触可塑性）以及病理学条件 (肿瘤恶性进展、癫痫)下进行的多种功能需要能够评估其蛋白裂解活性的工具。近年来，人 们目睹了大量功能成像技术的发展，其提供了在活细胞中测量并定位MMP-9活性的方式。然 而，所有这些方法都依赖于外部应用可被MMP-9裂解的荧光探针。遗传编码的、锚定于膜的 基于FRET的丽P-9活性生物传感器可能更适合于阐明生理学和病理学过程中MMP-9的蛋白 裂解活性。因此，需要开发一种生物传感器，使得在细胞上MMP-9作用的精确区域以高时空 分辨率研究MMP-9的蛋白裂解活性成为可能，且其可在活细胞中进行体外和体内应用。 专利技术概述本专利技术提供了一种遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器，其克服了目前 可得的生物传感器的局限，使得对MMP-9的基础生理学和病理学作用的研究成为可能。 本专利技术的遗传编码的MMP-9活性生物传感器包含被变连接子隔开的一个FRET供体 荧光蛋白和两个FRET受体荧光蛋白，其中供体和受体之间的连接子含有合成的MMP-9裂解 位点，并且整个生物传感器锚定于质膜上。 优选地，本专利技术生物传感器中的所述FRET供体荧光蛋白选自单体蓝绿色(teal)荧 光蛋白mTFPl和三叶草荧光蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
遗传编码的MMP‑9活性生物传感器，其包含一个FRET供体荧光蛋白和两个FRET受体荧光蛋白，都通过可变连接子隔开，其中供体和受体蛋白质之间的连接子含有MMP‑9裂解位点且整个生物传感器锚定于质膜上。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·斯塔沃斯基，J·沃劳达克兹克，L·卡克兹马雷克，
申请(专利权)人：生物实验研究所马塞尔南凯哥波兰科学院，
类型：发明
国别省市：波兰;PL
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。