一种基于荧光猝灭的蛋白激酶活性分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光猝灭的蛋白激酶活性分析方法，该方法首先将靶标蛋白激酶与其对应的荧光标记多肽底物混合，使底物多肽中的特定氨基酸位点发生磷酸化反应，然后利用纳米二氧化铈能够快速、高选择性的吸附生成的磷酸化荧光标记多肽底物，导致其荧光发生猝灭，而未磷酸化的荧光多肽底物与二氧化铈的相互作用非常微弱，不会造成荧光信号的猝灭，因此，通过监测体系中荧光信号的猝灭情况，即可实现蛋白激酶活性的准确分析。本发明专利技术只需将蛋白激酶反应体系与纳米二氧化铈混合后即可直接进行荧光信号的测量，利用简便的操作步骤实现了蛋白激酶活性的即混即测型快速分析。同时本发明专利技术方法可应用于蛋白激酶抑制剂的筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及一种以纳米二氧化钟(Nano Ceria)为磷酸化多肽特异性识别以及荧光猝灭元件，操作简单、成本低廉的即混即测型蛋白激酶活性检测方法。
技术介绍
细胞信号转导，是指细胞外信号分子通过与细胞表面或胞内受体的结合，引发胞内级联反应，进而调节胞内特定蛋白酶的活性或诱导特定基因的表达，使细胞发生应答反应的过程。在此过程中，蛋白质磷酸化发挥着至关重要的作用，细胞内大部分的生命过程，如代谢、物质运转、生长、发育、凋亡、神经活动等都与蛋白质磷酸化密切相关。蛋白激酶是调控蛋白质磷酸化的最重要的生物分子。蛋白激酶是能够将Y-磷酸基团从腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)上转移至底物蛋白特定氨基酸残基上的一大类酶，目前已发现的蛋白激酶超过500种，人体约30%的蛋白质受到激酶的调控。其一方面通过磷酸化作用调节下游蛋白质的活性，另一方面通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大引起细胞反应。因此，蛋白激酶的活性失调会引起细胞内多种信号通路出现传导异常，导致老年痴呆、肿瘤等多种疾病。例如，蛋白激酶B (PKB)在许多恶性肿瘤中都有着过高的活性，肿瘤细胞的增殖往往都伴随着多种酪氨酸激酶(PTK)活性的异常活跃；而蛋白激酶A(PKA)的活性失调与老年痴呆症的发生密切相关。由于许多重大疾病的发生都与蛋白激酶活性异常活跃密切有关，因此对蛋白激酶活性进行准确监测是深入揭示疾病发生机制，对相关疾病进行早期诊断的重要途径。此外，设计和开发以蛋白激酶为靶点的新药，通过抑制过高的蛋白激酶活性进而有效调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种高效的途径。这也使得蛋白激酶成为治疗癌症、糖尿病、老年痴呆等复杂疾病的重要药物靶点，据报道，当前很大一部分新药的研发都是以蛋白激酶作为作用靶点的。因此，开发建立操作简单、成本低廉、快速灵敏的蛋白激酶活性分析方法，是相关领域研宄的关键基础和前提。传统的蛋白激酶活性检测方法可大致归结为如下几类:(I)放射性标记技术，曾是蛋白激酶活性分析的标准方法。但存在放射性污染问题，对人体及环境都存在一定危害，因此虽尚有一些应用，但正逐渐被其它技术所取代。(2)基于抗体的识别技术。利用对特定磷酸化氨基酸位点具有特异性识别能力的亲和抗体，结合荧光、光散射、电化学及比色等各种检测技术，是当前蛋白激酶活性分析领域最为活跃的研宄方向。虽然该类方法目前已经取得了很好的进展，但仍面临着如下挑战:首先，磷酸化识别抗体制备复杂，检测不同的激酶需要不同的抗体，成本高，且其活性会受到储存环境、反应介质及个人操作等多种因素的影响，对检测结果的稳定性造成较大影响。其次，基于抗体识别的蛋白激酶活性检测方法往往需要在抗体上面预先连接荧光或电化学活性的标记物，这就大大增加了操作的复杂性，限制了其应用范围。另外，多数磷酸化识别抗体都是活性蛋白，以此类激酶活性检测方法进行酶抑制剂药物筛选和开发时，有时很难区分抑制作用是来源于待筛选的分子对激酶还是对抗体活性的抑制，不适于大规模的抑制剂药物筛选。因此，考虑到蛋白激酶抑制剂筛选工作量大以及检测成本等各方面的需要，理想的蛋白激酶活性检测方法应摆脱对识别抗体和放射性标记的依赖性，且需满足操作简便、成本低廉、灵敏度高等特点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、成本低、快速灵敏、无需复杂仪器的即混即测型(mix-and-read)蛋白激酶活性分析方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成:由下述步骤组成:1、将已知活性的蛋白激酶与其对应的荧光标记多肽底物混合进行磷酸化反应。2、将纳米二氧化铈水溶液与步骤I中磷酸化反应后的溶液混合，检测混合体系的荧光强度，根据不同活性蛋白激酶对应的荧光强度绘制标准曲线。3、按照上述步骤I和2测试待测蛋白激酶对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测蛋白激酶活性的定量分析。上述步骤I中，所述的荧光标记多肽底物中的荧光标记物为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及其衍生物中的任意一种或花青染料或半导体量子点，具体如:羧基四甲基罗丹明、2，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料等；所述的蛋白激酶是能够将丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸蛋白磷酸化的激酶，具体如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、SRC激酶等。上述步骤2中，优选按照每微摩尔荧光标记多肽底物加入10?80mg纳米二氧化钟，且控制混合体系中纳米二氧化钟的浓度为15?120 μ g/mL ;进一步优选按照每微摩尔荧光标记多肽底物加入20?60mg纳米二氧化铈，且控制混合体系中纳米二氧化铈的浓度为40?80 μ g/mL ;其中所述的纳米二氧化钟的粒径为5?lOOnm。本专利技术的有益效果如下:1、本专利技术首次提出利用纳米二氧化铈可通过其表面铈离子与磷酸基团的强结合能力选择性捕获蛋白激酶催化生成的磷酸化多肽底物，以及二氧化铈对吸附在其表面的荧光染料的强猝灭能力，构建非放射性、非抗体依赖性蛋白激酶活性分析方法，该方法除了必需的蛋白激酶反应体系外，只需要二氧化铈这一种额外的检测试剂，克服了传统放射性标记及抗体识别方法中存在的放射性危害、步骤繁琐、成本高昂、需要专业人员操作等不足，具有快速可靠、经济灵敏等诸多的优势，在普通的化学及生物相关实验室均可进行。2、本专利技术所建立的蛋白激酶活性分析方法操作极为简便，只需将蛋白激酶反应体系直接与纳米二氧化铈溶液混合后即可马上进行荧光信号的读出，真正实现了即混即测型的蛋白激酶活性分析。3、荧光分析方法非常适合于与一些自动化仪器相结合进行高通亮检测，因此本专利技术提出的这种操作简单、成本低廉的分析方法在高通量蛋白激酶抑制剂的筛选研宄中也展现出了独特的优势。【附图说明】图1是荧光强度随PKA活性变化的荧光光谱图。图2是(Ftl-F)/Ftl值随PKA活性变化的线性曲线图。图3是蛋白激酶C(PKC)对应的荧光标记未磷酸化多肽底物在加入纳米二氧化铈前(曲线a)、后(曲线b)的荧光光谱图。图4是蛋白激酶PKC对应的荧光标记磷酸化多肽底物在加入纳米二氧化铈前(曲线a)、后(曲线b)的荧光光谱图。图5是荧光强度随抑制剂H-89浓度变化的荧光光谱图。图6是荧光强度随抑制剂H-89的浓度对数值变化的曲线图。【具体实施方式】下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例1以PKA为例，其活性分析方法如下:1、将6 yL50 μπιο?吨4羧基四甲基罗丹明标记的多肽(由吉尔生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列为LRRASLG)水溶液、4.8 μ L500 ymol.T1ATP水溶液加入离心管中，然后加入不同体积的0.1U.μ L-1或IU.μ L ^的PKA水溶液并用5OmmoI.L ^1Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.5，25°C，含1mmol.T1MgCl2)定容至100 μ L，使所得混合体系中PKA活性分别为 0,0.0001,0.0005,0.001,0.002,0.005,0.01,0.02,0.03,0.05,0.1,0.5U.μ ?Λ在恒温培养振荡器上37°C温育60分钟，进行磷酸化反应。2、向步骤I中磷酸化反应后的溶液中加入100 UL 120本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光猝灭的蛋白激酶活性分析方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)将已知活性的蛋白激酶与其对应的荧光标记多肽底物混合进行磷酸化反应；(2)将纳米二氧化铈水溶液与步骤(1)中磷酸化反应后的溶液混合，检测混合体系的荧光强度，根据不同活性蛋白激酶对应的荧光强度绘制标准曲线；(3)按照上述步骤(1)和(2)测试待测蛋白激酶对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测蛋白激酶活性的定量分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘成辉，孙素娟，李正平，申海霞，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61