本发明专利技术提供了一种基于寡核苷酸链敏化的稀土铕离子构建的荧光探针及其检测三价铁离子的方法及应用，在缓冲溶液中加入含20个胸腺脱氧核糖核苷酸的寡链DNA和铕离子，待铕离子被敏化完全且稳定后形成荧光探针体系后加入待测样品，用时间分辨荧光分析方法来测定三价铁离子浓度。本发明专利技术改变了目前常用的检测模式，无需复杂的样品前期处理，避免检测物损失，无需昂贵仪器，节约成本。本发明专利技术检测方法具有响应快、灵敏度高、选择性好、生物相容性好等优点，实时温和实用有效，具广泛应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建的荧光探针及其检测三价铁离子的用途及方法。
技术介绍
作为人体必需的微量元素，铁离子和含铁蛋白发挥着至关重要的作用，涉及血液中氧的运输，DNA合成，细胞扩散等众多重要的生命过程。铁离子的缺少或过量存在都会导致一些生理功能的缺失和疾病的发生，例如缺铁性贫血、高血压、不孕不育、中风等。因此对生物体内中三价铁离子的测定具有非常重要的意义。目前常规的方法如下表所示：原子吸收光谱法(AAS)；电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)；电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)；阴极溶出伏安法(CSV)；流体注射与化学发光检测法；荧光法等。传统的三价铁离子的检测方法一般需要昂贵的大型仪器来完成对三价铁离子的检测；而这个过程需要复杂的前期准备，对样品具有破坏性同时也会造成检测物的损失，在实时原位高通量快速检测方面存在着局限性。同时，这些方法在快速实时、高灵敏、高选择性检测时对操作人员提出了很高的要求，检测成本一般较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建荧光探针检测血液中三价铁离子的用途及方法，以克服现有检测三价铁离子的方法中复杂的前期准备及昂贵的大型仪器，难以实现原位实时高通量快速检测，不利于大规模推广的缺陷。本专利技术首次提出了一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针，所述荧光探针为以胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链oligoT20敏化铕离子形成的荧光探针；所述荧光探针用于检测三价铁离子。本专利技术人经过研究4段分别富含20个不同脱氧核苷酸的寡核苷酸链(oligoA20，oligoT20，oligoG20和oligoC20)与稀土铕离子反应，发现只有胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链(oligoT20)可以有效敏化铕离子使其产生很强的荧光发射。用这个oligoT20敏化的稀土铕离子作为荧光探针，在缓冲液的环境中荧光可以保持稳定，而当加入三价铁离子后，荧光会发生淬灭，如图1。基于以上实验发现，本专利技术提出用oligoT20敏化稀土铕离子将其发展成为一种能够检测三价铁离子的荧光探针，实现对三价铁离子实时原位的高灵敏度定量检测，并应用于生物血液中三价铁离子的测定。本专利技术还提出了一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建荧光探针检测三价铁离子的方法：首先，筛选出有效的配体寡脱氧核苷酸链(oligoT20)来敏化稀土铕离子产生荧光而制成所述基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针；其次，向构建的所述荧光探针中加入三价铁离子标准溶液或血液样品溶液进行反应发生荧光淬灭；采用时间分辨荧光分析的方法实现对三价铁离子的检测。本专利技术检测方法包括以下步骤：(1)筛选胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链(oligoT20)用于敏化稀土铕离子构建荧光探针，实现对三价铁离子的定量检测。所述荧光探针中，oligoT20的终浓度为10μM，稀土铕离子的终浓度为1mM，所用的缓冲液为Tris-HCl，反应浓度为10mM，所述缓冲液的pH值为7.0～9.0；优选地，pH＝7.4。所述反应温度为室温。所述铕离子为1mM三价铕离子。(2)向获得的oligoT20敏化的稀土铕离子构建荧光探针中加入待测的三价铁离子标准溶液或血清样品进行反应。所述待测的三价铁离子标准溶液的浓度为0～60μM。所述待测样品包括血液样品、血清样品等。在具体实施方案中，血清样品为大鼠血清样品。(3)通过时间分辨荧光分析方法实现对三价铁离子的检测。随着三价铁离子浓度的增加，oligoT20敏化的稀土铕离子构建荧光探针的荧光逐渐降低，即，618nm处的荧光发射峰逐渐降低，建立工作曲线及标准方程，用荧光值的高低来定量检测三价铁离子的含量。本专利技术方法的整个反应体系可控制在微升级别，体积为100μL。优化实验方案可表述如下：取10μL待测溶液加到90μL荧光探针溶液中，孵育10分钟。通过时间分辨荧光光谱法进行检测。所述荧光探针中，所述寡脱氧核苷酸链的反应浓度为4～20μM，优选地，为10μM。所述铕离子的浓度为0.5～2mM,优选地，为1mM。所述待测三价铁离子溶液的反应浓度为0～60μM。所述缓冲液为Tris-HCl，其浓度为10mM，pH值为7.0～9.0；优选地，pH＝7.4。所述反应温度为4～40℃，优选地，为室温条件下。所述反应时间为5～20分钟，优选地，反应时间不超过10分钟。本专利技术方法为微量检测方法。在具体实施方案中，本专利技术方法的最低检测浓度为0.23μM三价铁离子溶液。与现有技术相比，本专利技术有益效果包括如下：本专利技术改变了目前常用的检测三价铁离子的检测模式，无需复杂的前期样品准备，不需要使用昂贵的大型仪器，节约了成本。本专利技术是目前第一次报道采用寡聚DNA敏化稀土铕离子作为荧光探针，并利用时间分辨荧光分析方法实现对血液中三价铁离子的检测。本专利技术检测方法用量少，整个反应体系仅需微量级的即可，节约了探针的使用量(例如，100μL检测反应体系中用90μL荧光探针溶液)，实现了微量低成本的检测。由于用寡聚DNA作为敏化配体，材料获取简单价格低廉，应用到血液中三价铁离子的检测实用性强。本专利技术检测方法使用敏化后的稀土铕离子的荧光作为信号，具有很长的荧光寿命(达到ms级)，从而可以采用时间分辨荧光分析的方法，能够有效消除检测过程中的背景荧光和散射荧光的影响，从而可以显著提高灵敏度和信噪比。三价铁离子的检出限可达到0.23μM。本专利技术检测响应速度快，直接采用寡聚DNA链敏化稀土铕离子进行检测，整个检测三价铁离子过程不超过10分钟。本专利技术方法测定三价铁离子的浓度范围0～60μM。线性范围0～10μM(线性方程：Y＝-0.030647X+1.001R2＝0.9911)。最低检测浓度为0.23μM，具有很好的灵敏度。附图说明图1是本专利技术的原理示意图。图2是本专利技术对寡脱氧核苷酸链的选择和浓度的确定。图3是本专利技术对检测oligoT20敏化的铕离子荧光寿命的实验结果。图4是本专利技术检测三价铁离子灵敏度响应的实验结果。图5是本专利技术检测三价铁离子的干扰离子的对比结果。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。荧光光谱检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针在三价铁离子检测中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针在三价铁离子检测中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述寡核苷酸链是含20个胸腺嘧啶脱氧核苷酸
的寡链DNA。
3.一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为以胸腺嘧
啶寡脱氧核苷酸链oligoT20敏化铕离子形成的荧光探针；所述荧光探针用于检测三价铁离
子。
4.一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针检测三价铁离子的方法，其特征在于，所
述方法为：在含缓冲液的溶液中加入寡脱氧核苷酸链和铕离子，待铕离子被敏化完全且稳
定形成荧光探针体系后，在所述荧光探针体系中加入待测三价铁离子溶液和/或待测样品
溶液进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：施国跃，张闽，薛诗凡，蒋小琴，马诗诗，陈洁琼，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。