【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞外囊泡分离，具体涉及一种抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料和分离方法。
技术介绍
1、细胞外囊泡(evs)是由细胞分泌的带有磷脂双分子层的囊泡。在生理和病理条件下，几乎所有类型的细胞都可以释放evs，evs通过转运关键蛋白质和遗传物质如mirna、mrna和dna在细胞通讯和表观遗传调控中发挥重要作用。建立从体液中富集evs的有效的方法可以帮助更好地了解evs的分子组成及生理功能，对evs进行相关功能分析，有助于了解多种疾病的发生机制，用于疾病诊断及预后评估。
2、目前evs的分离方法主要有超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法，以及基于免疫亲和的分离方法。基于密度差异的超速离心法是应用最为广泛的方法，可对大体积体液样品进行分离且产量较高，但样品中密度相近的蛋白质颗粒不可避免地混合在evs中一同分离，而且高速离心会造成evs破损和有效信息的丢失。尺寸排阻色谱法和超滤法主要是基于evs的尺寸，通过截留，获得尺寸在一定范围的成分，富集效率高。在体液中，难以避免大小相似的组分同时被截留，如血液样品中的血小板、脂蛋白等组分，导致分离纯度低。免疫亲和法基于evs表面存在的一些特殊抗体，通过特定的识别作用实现evs的分离，选择性强，分离纯度高。但由于evs的异质性会造成目标evs的丢失。
3、目前的分离技术和方法存在耗时长、纯度低、evs完整性不足等缺点，影响了evs下游研究的准确性和可靠性，也制约了evs在临床的应用。因此，如何简化提取过程、提高evs的产量及纯度，探索一种高效、快速的
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服目前分离纯化evs的纯度低、影响evs下游研究的缺陷问题，提供一种通过简单的生物偶联方法制备的磷脂特异性识别肽偶联抗蛋白黏附的二氧化硅微球——抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，以及采用该分离材料分离evs的方法，该方法能够实现evs的高纯度分离，操作简单而快速，且不影响evs的结构形态和生理功能。
2、为达到上述目的，本专利技术提供的抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料是在二氧化硅微球表面修饰相转变牛血清白蛋白纳米薄膜，得到抗蛋白黏附的二氧化硅微球，在抗蛋白黏附的二氧化硅微球表面修饰磷脂特异性识别肽；所述二氧化硅微球的粒径为1～10μm，所述磷脂特异性识别肽(pep)的氨基酸序列为lys lys lys cys leu ile lys lyspro phe his his arg，简写为kkkclikkpfhhr。
3、上述抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料由下述步骤制备得到：
4、步骤1：将20～80mmol/l三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)水溶液用naoh调节至ph值为4.0～6.0，然后将其与1～20mg/ml牛血清白蛋白(bsa)水溶液按体积比为1:1混合均匀，并将二氧化硅微球分散在所得混合液中，室温孵育30～80分钟，使二氧化硅微球表面粘附一层相转变bsa纳米薄膜，得到抗蛋白黏附的二氧化硅微球；
5、步骤2：将1～10mg/ml 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)的4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液和1～10mg/ml n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)的mes缓冲液按体积比为1:1混合，并将抗蛋白黏附的二氧化硅微球分散在所得混合液中，室温反应30～120分钟，得到羧基被活化的抗蛋白黏附的二氧化硅微球；
6、步骤3：将0.1～10mg/ml pep的磷酸盐(pbs)缓冲液加入到羧基被活化的二氧化硅微球中，室温反应8～14小时，得到pep偶联抗蛋白黏附的二氧化硅微球，即抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料。
7、采用上述抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料分离evs的方法包括下述步骤：
8、步骤1：将抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料分散在分离缓冲液中，与生物样品混合并孵育，得到孵育后的混合物；
9、步骤2：离心分离孵育后的混合物，弃去上清，得到吸附evs的组合物；
10、步骤3：用10～20mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液洗涤步骤2得到的组合物，将洗涤后的组合物与洗脱缓冲液混合并孵育，所述洗脱缓冲液为10～40mmol/l乙二胺四乙酸二钠(edta)的hepes缓冲液，低速离心使固液分离，收集evs提取液。
11、上述分离纯化evs的步骤1中，所述生物样品为细胞培养上清液、血清、血浆、尿液等实际样品中任意一种，所述分离缓冲液为含有5～20mmol/l ca2+的hepes缓冲液。优选生物样品与抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料的质量比为50μl～4ml：6 mg，生物样本与抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料孵育的时间为30～80分钟，孵育温度为30～37℃，孵育时轻微震荡。
12、上述分离纯化evs的步骤3中，组合物为捕获了evs的抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，优选用10～20mmol/l的hepes缓冲液洗涤组合物的次数为2～3次，洗涤后的组合物与洗脱缓冲液的质量比为6mg：0.1～1ml。优选组合物与洗脱缓冲液的孵育时间为10～30分钟，孵育温度为24～28℃，孵育时轻微震荡。
13、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
14、(1)本专利技术提供了一种更简单的方法来制备evs的选择性分离材料，操作便捷省时，所涉及的试剂安全无毒，适用于生物样品的分离应用；
15、(2)本专利技术通过在二氧化硅微球表面修饰相转变bsa纳米薄膜，克服了二氧化硅微球对evs及蛋白的非特异性吸附，可以减少evs分离过程中杂蛋白的污染；
16、(3)本专利技术基于evs膜表面的磷脂，选择磷脂特异性识别肽来识别体液样本中的evs，有效克服了常规的evs分离技术存在的因evs的异质性所造成的目标evs的丢失及对脂蛋白等杂质共分离的缺陷，极大提高了evs分离的纯度，分离特异性强；
17、(4)本专利技术借助于磷脂特异性识别肽与evs膜表面磷脂的特异识别作用是ca2+依赖性的机理，通过添加螯合剂edta络合ca2+，可以无损释放特异性捕获的evs，洗脱方式更温和，保持了evs的结构及生物学完整性，操作简单，耗时短，便于evs的下游应用。
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1.一种抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，其特征在于，所述分离材料是在二氧化硅微球表面修饰相转变牛血清白蛋白纳米薄膜，得到抗蛋白黏附的二氧化硅微球，在抗蛋白黏附的二氧化硅微球表面修饰磷脂特异性识别肽；所述磷脂特异性识别肽的氨基酸序列为Lys Lys Lys Cys Leu Ile Lys Lys Pro Phe His His Arg。
2.根据权利要求1所述的抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，其特征在于，所述分离材料由下述步骤制备得到：
3.一种以非疾病治疗和诊断为目的的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
4.根据权利要求3所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，生物样品与抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料的质量比为50μL～4mL：6mg。
5.根据权利要求3或4所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，所述生物样品为细胞培养上清液、血清、血浆、尿液中任意一种。
6.根据权利要求3所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，所述分离缓冲液为含有5～20mmol/
7.根据权利要求3所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，所述孵育的时间为30～80分钟，孵育温度为30～37℃，孵育时轻微震荡。
8.根据权利要求3所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤3中，用10～20mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤步骤2得到的组合物2～3次，将洗涤后的组合物与洗脱缓冲液按质量比为6mg：0.1～1mL混合并孵育。
9.根据权利要求3或8所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤3中，所述孵育的时间为10～30分钟，孵育温度为24～28℃，孵育时轻微震荡。
...【技术特征摘要】
1.一种抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，其特征在于，所述分离材料是在二氧化硅微球表面修饰相转变牛血清白蛋白纳米薄膜，得到抗蛋白黏附的二氧化硅微球，在抗蛋白黏附的二氧化硅微球表面修饰磷脂特异性识别肽；所述磷脂特异性识别肽的氨基酸序列为lys lys lys cys leu ile lys lys pro phe his his arg。
2.根据权利要求1所述的抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料，其特征在于，所述分离材料由下述步骤制备得到：
3.一种以非疾病治疗和诊断为目的的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
4.根据权利要求3所述的分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，生物样品与抗蛋白黏附的细胞外囊泡选择性分离材料的质量比为50μl～4ml：6mg。
5.根据权利要求3或4所述的分离细胞外囊泡的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张静，何宇兴，杨叶童，杨旭文，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：
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