金属离子介导的荧光超猝灭分析、试剂盒以及试剂制造技术

描述了用于激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性的试剂和分析，该试剂和分析使用金属离子－磷酸盐配体的特异性结合和荧光聚合物的超猝灭。该分析应用肽和蛋白底物，为激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性测定提供了普遍性平台。也描述了基于ＤＮＡ杂交的试剂和分析以及应用适体、抗体和其它配体的用于蛋白的试剂和分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请通常涉及用于检测生物分子的试剂、试剂盒和分析方法，特别涉及将金属离子结合与荧光聚合物超猝灭组合的用于检测生物分子的试剂、试剂盒和分析方法。
技术介绍
酶联免疫吸附分析(即ELISA)是最广泛应用且公认的，用于对广泛的蛋白质、抗体、细胞、病毒等等的存在和生物活性进行鉴别的技术。ELISA是一个多步骤的“三明治分析”，其中分析物生物分子首先与附着在表面上的抗体结合。然后第二抗体结合该生物分子。在一些情况下，第二抗体附着在催化酶上，该催化酶随后“发展”放大反应。在其它情况下，第二抗体被生物素化以结合第三蛋白(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素)。此蛋白质或者附着在引起化学级联反应而放大比色变化的酶上，或者附着在用于荧光标记的荧光团上。尽管其被广泛应用，但ELISA仍存在许多缺点。例如，由于该多步法要求精确的控制试剂和发展时间，因此其费时且具有“假阳性”倾向。另外，必须要求仔细的清洗以除去非特异性的吸附试剂。荧光共振能量转移(即FRET)技术用于基于聚合酶链式反应(PCR)的基因序列分析和免疫分析。FRET应用分析物生物分子的同种(homogeneous)结合以活化染料的荧光，该荧光在基态(off-state)时猝灭。在FRET技术的常规例子中，荧光染料连接到抗体上(F-Ab)，此二联体(diad)结合到与猝灭剂偶联的抗原(Ag-Q)。该结合复合物(F-Ab:Ag-Q)通过能量转移来猝灭(即非荧光性)。在同样的未束缚至Q的分析物抗原(Ag)存在的情况下，该Ag-Q二联体被定量置换，该置换通过由相对浓度/确定的平衡结合可能性来测定。这限制了FRET应用于抗原已被充分表征(well-characterized)的定量分析，而且对每一种新情况，必须解决将抗原连接至Q的化学方法。其它FRET底物及分析在美国专利第6,291,201号，以及下列文章中公开Anne等人“用于测定肉毒杆菌B型神经毒素蛋白酶活性的高通量荧光分析”(High Throughput Fluorogenic Assay for Determination ofBotulinum Type B Neurotoxin Protease Activity)，Analytical Biochemistry(分析生物化学)，291，253-261(2001)；Cummings等人“用于炭疽杆菌致死因子蛋白酶的基于肽的荧光共振能量转移分析”(A Peptide BasedFluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Bacillus Anthracis LethalFactor Protease)，Proc.Natl.Acad.Scie.99，6603-6606；Mock等人“炭疽杆菌致死活性因子的快速筛选进展”(Progress in Rapid Screening of BacillusAnthracis Lethal Activity Factor)，Proc.Natl.Acad.Sci.，99，6527-6529(2002)；Sportsman等人Assay Drug Dev.Technol.，2004，2，205；和Rodems等人Assay Drug Dev.Technol.，2002，9。其它应用分子内猝灭的荧光底物的分析方法在以下文章中公开Zhong等人“用于大肠杆菌前导肽酶的内部猝灭的荧光底物的发展”(Development of an Internally Quenched Fluorescent Substrate forEscherichia Coli Leader Peptidase)。Analytical Biochemistry 255，66-73(1998)；Rosse等人“应用组合多肽库的新蛋白酶底物的快速鉴别”(RapidIdentification of Substrates for Novel Proteases Using a CombinatorialPeptide Library)，Comb.Chem.，2，461-466(2000)以及Thompson等人“用于测定钙蛋白酶及其它蛋白酶活性的BODIPY荧光微板分析”(ABODIPY Fluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpainsand Other Proteases)，Analytical Biochemistry，279，(2000)。分析方法也得到了发展，其中荧光偏振已被测量并用于定量分析分析物的量。参见，例如Levine等人“应用荧光偏振测定特异性蛋白酶活性”(Measurement of Specific Protease Activity Utilizing FluorescencePolarization)，Analytical Biochemistry 247，83-88。也见Schade等人“BODIPY-a-酪蛋白，用于使用荧光偏振的蛋白酶分析的不依赖于pH的蛋白底物”(BODIPY-a-Casein，a pH-Independent Protein Substrate forProtease Assays Using Fluorescence Polarization)，Analytical Biochemistry243，1-7(1996)。然而，仍然需要以高灵敏度、快速并准确地检测和定量诸如酶和核酸的生物学相关分子。专利技术概述根据第一实施方案，提供了复合物，其包含生物素化的多肽，其中该多肽包含一个或多个磷酸基；及与该多肽的磷酸基结合的金属阳离子。根据第二实施方案，提供了检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法。此实施方案的方法包括a)将样品与生物素化的多肽孵育，其中，对于激酶分析物，所述多肽包含一个和多个可被该分析物磷酸化的基团，或者，对于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一个或多个可被该分析物脱磷酸化的基团；b)向所述样品加入金属阳离子，其中或者该金属阳离子是猝灭剂，或者该方法还包括向该样品加入可与该金属阳离子结合的猝灭剂；c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭(superquenching)，其中该荧光剂结合到生物素结合蛋白；以及d)检测荧光，其中所检测的荧光表示该样品中分析物的存在和/或数量。根据第三实施方案，提供了筛选作为激酶或磷酸酯酶活性抑制剂的化合物的方法。此实施方案的所述方法包括a)在所述化合物的存在下，在样品中将生物素化的多肽与激酶或磷酸酯酶孵育，其中，对于激酶分析，该多肽包含一个或多个可被所述分析物磷酸化的基团，且对于磷酸酯酶分析，该多肽包含一个或多个可被所述分析物脱磷酸化的基团；b)向所述样品加入金属阳离子，其中或者该金属阳离子是猝灭剂，或者所述方法还包括向所述样品加入可与该金属阳离子结合的猝灭剂；c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中所述荧光剂结合到生物素结合蛋白；以及d)在所述化合物的存本文档来自技高网...

【技术保护点】
复合物包含：生物素化的多肽，其中所述多肽包含一个或多个磷酸基；以及与所述多肽的磷酸基结合的金属阳离子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏文胜，弗劳克里尼斯兰德，西瑞兰姆库马尔阿斯万，斯图尔特库顺，卢良德，
申请(专利权)人：QTL生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]