用于表征SSDNA序列的DSDNA结合染料和探针的组合制造技术

本发明专利技术包括利用当与双链结合时发出荧光的染料(所谓的DNA结合染料或dsDNA-染料)分析单链核酸序列(RNA序列或者DNA序列(ssDNA))的方法。根据本发明专利技术的方法利用dsDNA-染料与一个或多个杂交探针的组合，所述探针杂交于靶核酸序列并用非荧光猝灭剂部分例如黑洞猝灭剂标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于表征SSDNA序列的DSDNA结合染料和探针的组合 相关申请的交叉参照 本申请要求2012年9月17日提交的美国临时专利申请61/702, 019的优先权，该申请 通过引用W其整体结合到本文中。 本专利技术设及核酸序列的巧光检测方法，并且设及用于进行该样的方法的试剂盒。 [000引专利技术背景 单链核酸祀序列的检测和分析可包括使用巧光标记的寡核巧酸杂交探针、引物或二 者。检测可能是或可能不是"均相检测"。均相检测意思是不需要使结合的（杂交于祀的） 引物或探针与未结合的引物或探针分离的检测。在适合于均相检测的探针中有一端用巧光 团标记而另一端用巧灭剂（最常用的为非巧光巧灭剂）标记的线性探针（例如，在Livak等 人（1995)PCRMethodsAppl. 4:357-362中描述的5'核酸外切酶探针）、一端用巧光部 分例如巧光团标记而另一端用巧灭剂标记的发夹探针（例如，在Tyagi等人（1996)化化re Biotechnology14:303-308中描述的分子信标探针）、在一条链上具有巧光团而在另一条 链上具有巧灭剂的双链探针（例如，在Li等人（2002)Nucl.AcidsRes. 30，No. 2e5 中描述的阴阳探针）、具有吸收来自巧光染料的发射和W较长的波长再发射的巧光团的线 性探针（例如，在美国公布的专利申请US2002/0110450中描述的探针）和线性探针对，其 中一个探针用供体巧光团标记和一个探针用巧灭剂或受体巧光团标记，它们彼此在祀链上 接近地杂交，W致它们的标记相互作用。标记对例如巧光团和巧灭剂可通过FRET相互作用 (例如，在美国专利6, 140, 054中描述的FRET探针对）。作为对FRET巧灭的替代，分子信标 探针、5'核酸外切酶探针和阴阳探针可利用接触巧灭，该不需要巧光部分的发射光谱和巧 灭剂的吸收光谱之间的大量的光谱重叠。Tyagi等人（1998)化化reBiotechnology16: 49-53;欧洲专利EP0 892 808。公布的国际专利申请WO2011/050173公开了单链核酸祀 序列的分析，该分析通过杂交于祀序列多个探针（包括一个或多个"化"探针（在杂交时发 信号的巧光团/巧灭剂双重标记的探针）和一个或多个"Off"探针（在杂交时巧灭从"化" 探针发出的巧光的巧灭剂-标记的探针））和分析作为温度的函数的"化"探针的巧光团的 巧光（一般借助于解链曲线或退火曲线）来进行。DNA结合染料（dsDNA-染料）是当与双链核酸相互作用时发巧光的染料，例如SYBR?绿。dsDNA-染料已W两种方式用于核酸检测。第一种方式是检测双链，不论在单独 存在下还是在单链的存在下。该包括在双链的存在下刺激染料并检测从染料的发射。通 过dsDM-染料检测双链是非特异性的；即是说，它告知是否存在双链，但没有告知链的一 个或多个序列。第二种方式是将dsDNA-染料嵌入巧光标记的探针和单链祀的杂合体中，W 其吸收波长刺激染料并W其发射波长检测从探针的巧光标记的发射，其中探针的标记通过 FRET经染料的发射激发。由于该设及FRET,探针的巧光部分的吸收光谱必须显著重叠染料 的发射光谱。当染料通过检测作为双链的非特异性指示剂的染料发射和通过检测作为特定 序列的指示剂的探针发射与一个或多个探针结合使用时，通常有一种限制，即探针信号必 须可检测地不同于染料信号。由于最常用的dsDNA-染料SYBR感绿具有与最常用的探针巧 光部分（巧光团FAM)基本相同的发射光谱（见Van化ucke等人（2012)BioTechniques 52: 81-85的图1)，二者通常不能一起使用。另外见Lind等人（2006)BioTechniques40:315-318,该作者报告FAM具有在493皿的最大激发和在525皿的最大发射，而SYBR? 绿具有在497皿的最大激发和在516皿的最大发射。Lind等人通过使用FAM-标记的探 针，不是与SYBR绿，而是与可与FAM区分的不同dsDNA-染料即BEB0 (其具有在515nm最 大激发和在552nm的最大发射）解决了该问题。Van化ucke等人报告化qMan@ (5'核酸 酶）测定，一种生成携带巧光团标记的探针片断的对称PCR测定，其中探针的标记是FAM和 其中SYBR敬绿被用来检测制备的扩增子，在该种情况下为双链扩增子。解链峰在约82°C获 得。由于SYBR信号占优势，该指示双链的解链一一一种某些产物已制得的非特异性指示。 然后通过在较高的温度（在此温度双链解链，85°C)检测，作者断定由无模板对照（NTC)生 成的W上巧光是来自探针片断。支持该结论的是该样一个事实，即没有高温解链峰，不变地 是发巧光探针片断不产生解链峰。当然，没有检测探针-祀杂合体，因为它们将在低于双 链扩增子的解链温度的温度下烙解掉。NeitherLind等人和Van化ucke等人均没有利用 SYBR感绿dsDNA-染料分析单链。Van化ucke等人未使用FAM用于对作为温度的函数的探 针结合进行任何分析。 概述 本专利技术包括利用当与双链缔合时发出巧光的染料（所谓的DNA结合染料或dsDNA-染 料）分析单链核酸序列（RNA序列或者DNA序列（ssDNA))的方法。根据本专利技术的方法利用 dsDNA-染料与杂交于祀核酸序列并用非巧光巧灭剂部分例如黑洞炬lack化le)巧灭剂标 记的一个或多个杂交探针的组合。该样的探针一般在此称为"巧灭剂标记的探针"。根据本 专利技术的方法包括在包括一个或多个该样的杂交探针的解链温度的温度范围内，分析作为温 度的函数的来自dsDNA结合染料的巧光。祀序列可W是一个或多个探针与之完全互补或不 完全互补的序列。在某些实施方案中，巧灭剂标记的探针可W是如在下文解释的"原位探 针"。 为了在本专利技术的方法中使用dsDNA-染料，含有至少一个非巧光-巧灭剂标记的探 针的巧灭剂标记的探针或探针组可用来检测和分析它们所杂交的有关序列。可用于本专利技术 的方法中的探针组可另外包括一个或多个包含巧光巧灭剂标记或不包含任何巧灭剂标记 的探针。dsDNA-结合染料通常可用于本专利技术的方法中。最常用的dsDNA-结合染料 是SYBR③绿染料。其它dsDNA-染料包括漠化己锭、DAPI、B0和邸B0炬engtsson等人 (2003)NucleicAcidsResearch31:e45)。还有的另一种是B0XT0(Lind等人（2006) BioTechniques40:315-318)。据报道该些染料中的至少一些是小沟结合染料（minor groovebindingdyes)。在本专利技术的方法中dsDNA-染料可单独或组合使用。 可用于本专利技术的方法中的杂交探针包括线性的或无规卷曲探针和结构化探针二 者。它们可W是RNA、DNA或RNA和DNA的组合。它们可包括非天然核巧酸、核巧酸类似 物和非天然核巧酸间键合。增加探针的结合亲和力的非天然核巧酸和类似物包括，例如， 2'-0-甲基核糖核巧酸和PNA。结构化探针可包含一条链（例如，分子信标探针）或两条链 (例如，阴阳探针）。本专利技术的某些实施方案利用最初包含引物延伸和作为扩增后检测的部 分原位完成其构建的探针。为了方便起见，我们称该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分析作为温度函数的包含在至少一个核酸靶链的拷贝中的至少一个核酸靶序列的核酸含量的均相方法，其包括a) 提供含有所述至少一个呈单链形式的核酸靶链的拷贝的样品，所述拷贝具有与它们的互补核酸链有关的解链温度；b) 使所述单链拷贝与双链DNA结合染料(dsDNA‑染料)和探针组接触，所述探针组包括至少一个与所述至少一个靶序列互补并用至少一个非荧光部分标记的杂交探针，所述非荧光部分为dsDNA‑染料的猝灭剂；c) 在低于所述拷贝的解链温度的多个温度，使样品经受在适合于刺激染料的波长下的激发并在适合于检测来自dsDNA‑染料的发射的波长下检测发射；和d) 比较检测的发射与从至少一个其序列或性质已知的靶序列获得的相应的发射。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J赖斯，Y贾，LJ王，
申请(专利权)人：布兰代斯大学，
类型：发明
国别省市：美国;US