一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其设及一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基 因多态性的引物与方法。
技术介绍
目前已发现的CYP2C9等位基因有30种，其中WCYP2C9*1 (野生型）、 CYP2C9*2k. 430OT，Argl44Cys，rsl799853)、CYP2C9*3 (C. 1075A〉C，Ile359Leu， rsl057910)最为常见。CYP2C9*2和CYP2C9*3基因频率在不同人种和不同民族之间差异较大，在中国人 群中的等位基因频率远远低于白种人。研究表明，CYP2C9基因突变状态与华法林类药物临 床用药敏感性及毒性关系密切，携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明 显低于野生型，并且其出血的危险性增加2-3倍，CYP2C9*l/*3和CYP2C9*3/*3患者与野生 型患者相比，华法林用药分别要减少33. 7%和78. 1%。 中国专利申请201310533548. 8公开了一种用于CYP2C9和VK0RC1基因巧片检测 的特异性引物对和探针，但基因巧片的设计成本高，检测费用昂贵。现有技术缺少一种特异 性好、灵敏度高、可实现多个位点同时检测的CYP2C9和VK0RC1基因多态性检测引物及其方 法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3 基因多态性的引物与方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了CYP2C9*2 和CYP2C9*3基因多态性的同时检测。本专利技术同时检测的位点包括CYP2C9*2 (430C〉T， Argl44切s，rsl799853)W及CYP2C9*3(1075A〉C，Ile359Leu，rsl057910)。 本专利技术提供一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引物，包括PCR扩 增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对CYP2C9*2的上游引物5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3'（沈QIDNO. 1)和下游引物5'-CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG -3'669 10側.2)^及针对〔￥口2〔9*3的上游引物5'-〔4064464641764406161641'-3'（569 IDNO. 3)和下游引物 5,-TAATGTCACAGGTCACTGCATGG-3,（SEQIDNO. 4);所述挪aPshot PCR引物包括；针对CYP2C9*2 的SNaPshotPCR引物 5'-TTTTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGGAC -3,（沈QIDNO. 5)W及针对CYP2C9*3 的SNaPshotPCR引物 5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG GCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3'（SEQIDNO. 6)。 采用上述技术方案，本专利技术提供的同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的 引物，可W实现CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确 性好。[000引优选地，所述PCR扩增引物中，CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1 ;1 ;所述 SNaPshotPCR引物中，CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1 ;1。 相应地，本专利技术还提供一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的方法， 包括如下步骤;A)提取DNA样品；B)采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重 PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C)采用权利要求1或2中所述的SNaPshotPCR引物进行 SNaPshotPCR扩增，对扩增产物进行纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分 析，确定SNP位点及其基因型。 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。 优选地，述步骤B)中的多重PCR扩增反应条件包括；Step1: 98°C化r3min; Step2: 98°Cfor10s;St巧 3: 58°Cfor30s;Step4: 72°Cforlmin;Step5:Goto step2,29times；Step6: 72°Cfor5min；Step7: 25°Cforever。 优选地，所述步骤C)中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括；Step1: 96°C化r 10s;Step2: 55°Cfor日s;Step3: 60°Cfor30s;Step4:Gotostep1,25times; Step5: 4°Cforever。 优选地，所述步骤D)中，采用GE肥MAP阳RIDV4. 1软件对检测结果进行分析。 此外，本专利技术还提供同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引物在制备检 测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性试剂中的用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是；本专利技术提供了一种同时检测CYP2C9*2 和CYP2C9*3基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了 CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的同时检测，提高了检测效率。此外，本专利技术还提供了一 种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增 引物和SNaPshotPCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W为华法林的临 床用药提供指导。【附图说明】 图1本专利技术提供的CYP2C9*2和CYP2C9*3基因引物的扩增片段。 图2CYP2C9*2和CYP2C9*3基因引物扩增产物的部分测序图。 图3样品的CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性检测结果图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。 实施例一引物 专利技术人针对CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应 条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且PCR反应条件非常接近的引 物。本专利技术提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，PCR扩增引物 和SNaPshotPCR引物是相对应的。本专利技术提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对， 无已知SNP位点。实施例二引物的特异性 将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting,结果如下；扩增片 段位于chrlO:96701959-96702133间，长度为17化P;073(讲3扩增片段位于 C虹10:96740948-96741101，长度为154bp;结果如图1所示，所有引物的扩增片段均覆盖了 相应的检测位点；CW义讲2及0736讲3,无其它同源基因。 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，各引物扩增片段与CW义讲2及CW义讲3基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表 1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的 相对位置及测序反应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。 实施例二（阳义讲2及C巧基因多态性的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对CYP2C9*2的上游引物5’‑ CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG‑3’和下游引物5’‑CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG ‑3’以及针对CYP2C9*3的上游引物5’‑CAGGAAGAGATTGAACGTGTGAT‑3’和下游引物5’‑TAATGTCACAGGTCACTGCATGG ‑3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对CYP2C9*2的SNaPshot PCR引物5’‑TTTTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGGAC‑3’以及针对CYP2C9*3的SNaPshot PCR引物5’‑ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵薇薇，胡昌明，燕启江，郭周萍，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44