本发明专利技术涉及一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方法。将待测菌株于母种平板培养基中培养后，切取平板上的菌块，转至液体深层培养基中震荡培养，得菌液。取菌液于离心管中，离心，去除上清液，提取菌丝，以生理盐水冲洗菌丝。称量菌丝重量，加入水，配成待测菌液。准确移取待测菌液、Tris-HCl缓冲液和TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液至离心管中反应。反应后，立即将反应液放置冰上，4℃离心，得细胞沉淀，于离心后的细胞沉淀中加入萃取剂，得萃取液。将萃取液离心，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值。与传统的依据菌丝特征检测菌种活力相比该法具有测定结果稳定可靠、重现性好、准确度高、操作方便、速度快等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测酶活的方法，更具体的说是一种检测食药用菌菌丝活力的方 法，属于生理活性物质检测领域。
技术介绍
羊肚菌（MorchellaesculentaL.)又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，按 Ainsworth分类系统隶属于子囊菌亚门（Ascomycotina)、盘菌纲（Discomycetes)、盘菌目 (Pezizales)、羊肚菌科（Morchellaceae)、羊肚菌属（Morchella)。由于其菌盖是一个布满 凹陷和棱脊的网状体，形状似羊肚而得名。羊肚菌具有极高的营养价值和药用价值，是一类 大型的食用兼药用真菌。据测定，羊肚菌的蛋白质含量为22. 1%，含19种氨基酸以及锌、 硒、铁、锗、铜等多种微量元素和维生素&、B2、B12、烟酸、泛酸、生物素等多种维生素，其中包 括8种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的47. 5% ( -般食用菌为25%~40% )，高于玉米、 小麦、大豆和肉类食品，有些营养成分的含量超过了 "冬虫夏草"。现代医学研宄表明，羊肚 菌有降血脂，调节免疫功能，抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的 毒副作用。 羊肚菌在国际市场上供不应求，且价格居高不下。因此，人工栽培羊肚菌一直是食 用菌界最感兴趣的课题之一。我国目前已经成功栽培出羊肚菌，云南利用椴木栽培羊肚菌， 四川是利用耕地栽培羊肚菌。 羊肚菌菌种与其它食药用菌一样，属于真菌，遗传变异显著，优良性状不能完全稳 定遗传，且易老化或退化，给批量栽培带来了极大风险，也是比较棘手的问题。 如何选择优良的生产种是栽培成功的关键，传统的方法是依据形态特征、生理生 态特性和栽培习性进行选种，但是羊肚菌菌种要求外界条件严格，受外界因素影响明显，导 致该法不准确，且费时费力。如果能在羊肚菌菌丝生长阶段快速、准确的检测菌种活力将大 大提高选种效率，同时节省成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方 法，包括如下步骤： 1)菌丝培养：将待测菌株于母种平板培养基中培养后，切取平板上的菌块，转至 液体深层培养基中震荡培养，得菌液。 优选的，将待测菌株于母种平板培养基中，23°C下培养10d后，切取平板上的菌 块，转至液体深层培养基中，23°C下150rpm震荡培养6d，得菌液。 优选的，所述的母种平板培养基是：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨0.3%，腿 2?04 0.3%，]\%504.71120 0.15%，口11值7，水余量。 优选的，所述的液体深层培养基是：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨 0.3%，KH2P04 0.3%，MgS04.7H20 0.15%，维生素BJOmg/L，水余量。 2)样品前处理：取菌液于离心管中，离心，去除上清液，提取菌丝，以生理盐水冲 洗菌丝。 优选的，取菌液于离心管中，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，取菌丝，以生理 盐水冲洗菌丝。 3)配制待测菌液：称量菌丝重量，加入水，配成待测菌液。 优选的，待测菌液的浓度为0. 1-0. 2g/mL。更优选的，待测菌液的浓度为0. 15g/ mL〇 4)与TTC反应：准确移取待测菌液、Tris-HCl缓冲液和TTC(2,3,5-氯化三苯基四 氮唑）溶液至离心管中反应。 优选的，准确移取待测菌液、Tris-HCl缓冲液和TTC溶液至离心管中，于37°C下反 应 2-4h。 优选的，所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为8. 4。 5)终止反应：反应后，立即将反应液放置冰上，4°C离心，得细胞沉淀，于离心后的 细胞沉淀中加入萃取剂，得萃取液。 优选的，所述的萃取剂是无水乙醇。 6)测定萃取液0D485:将萃取液离心，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值。 优选的，将萃取液于12000rpm离心5min，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值 0D485〇 本专利技术的有益效果是： 1.本专利技术测定结果稳定可靠、重现性好、准确度高。酶是非常有效和特异性高的生 物催化剂。由于酶对环境条件的影响非常敏感，因此酶活性测定的影响因素较多，包括酶的 浓度、缓冲液类型、pH值、温度、时间等，而且不同生物体不同酶活性的测定条件并不一致。 本专利技术根据羊肚菌的特性，使TTC不易扩散进入细胞中的特点，经过反复试验，优化出最佳 试验方案，各种条件准确可控，测定结果准确度高、重现性好，并且稳定可靠。 2.本专利技术所用药品、仪器种类少，试验步骤简单，便于操作，易于学习和掌握。 3.本专利技术反应速度快，测定吸光度值简单、快速，整个检测过程时间短。 4.本专利技术所用药品、试剂便宜，用量少，试验成本低。 5.通过本专利技术的方法可以快速检测出羊肚菌菌种的优劣，再应用于扩大化生产 中，提高了成品的优质产率。【具体实施方式】 实施例 (一）供试菌株：所用供试菌株见表1。 表1供试菌株 (二）试剂： Tris-HCl缓冲液：pH8. 4 ;随用随配。 TTC溶液：重量百分浓度为0. 5 % ;随用随配。 生理盐水：重量百分浓度为0. 85% ; 母种平板培养基：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， 腿丨04 0.3%，]^04,71120 0.15%邛11值7，水余量。 液体深层培养基：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， KH2P04 0? 3%，MgS04 ? 7H20 0? 15%，维生素BilOmg/L，水余量。 (三）快速检测羊肚菌菌丝活力的方法 1)菌丝培养 将待测菌株于母种平板培养基中，23 °C下培养10d后，切取平板上的菌块(lcmXlcm) 2块，转至液体深层培养基中，23°C下150rpm震荡培养6d，得菌液。 2)样品前处理 取2mL菌液于离心管中，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，取菌丝，以1ml生理 盐水冲洗菌丝，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，重复4次。[0044当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方法，其特征在于包括如下步骤：1)菌丝培养：将待测菌株于母种平板培养基中培养后，切取平板上的菌块，转至液体深层培养基中震荡培养，得菌液；2)样品前处理：取菌液于离心管中，离心，去除上清液，提取菌丝，以生理盐水冲洗菌丝；3)配制待测菌液：称量菌丝重量，加入水，配成待测菌液；4)与TTC反应：准确移取待测菌液、Tris‑HCl缓冲液和TTC溶液至离心管中反应；5)终止反应：反应后，立即将反应液放置冰上，4℃离心，得细胞沉淀，于离心后的细胞沉淀中加入萃取剂，得萃取液；6)测定萃取液OD485：将萃取液离心，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李红，李超，刘娜，李宏亮，何雨，赵春燕，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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