本发明专利技术公开了一种巢式PCR法检测鱼类COⅠ基因的引物组及方法，该引物组包括两对引物，其中，第一对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；第二对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。采用本发明专利技术的引物组通过巢式PCR法扩增鱼类COⅠ基因，特异性好，能有效的将多数鱼类鉴定到种，具有准确可靠、灵敏度高、快速简便的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术的
，尤其涉及一种巢式PCR法检测鱼类CO I基因的引物组及方法。
技术介绍
鱼类的分类鉴定不仅是分类学研宄的内容，同时也是渔业调查、自然保护区评估、以及食品与药物原料鉴定的关键。当前，鱼类鉴定的方法仍以传统形态分类为主。传统形态分类主要根据已有资料的形态、生态学特征描述对采集到的样品进行比对鉴定，由于鱼类较高的形态多样性以及表型可塑性，仅靠形态特征很难进行准确鉴定。随着分子生物学技术的不断发展，DNA序列分析已经被广泛应用于动物进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护生物学领域。研宄发现动物的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因5’端序列种内的差异度明显低于种间，研宄证明以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (CO I )基因对脊椎动物和无脊椎动物分类鉴定是行之有效的，并已广泛应用于各种生物类群。越来越多的研宄表明，CO I基因在鱼类分类、物种鉴定、隐存种的发掘、系统发生研宄等方面都具有重要应用价值。有鉴于此，本专利技术人研宄和设计了一种巢式PCR法检测鱼类CO I基因的引物组及方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种巢式PCR法检测鱼类CO I基因的引物组及方法，通过利用本PCR引物组进行鱼类CO I基因的扩增，使得本专利技术可以方便、特异的扩增出不同鱼类CO I基因，进而辅助鱼类分类、物种鉴定、隐存种的发掘、系统发生等研宄工作。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题的技术方案是:一种巢式PCR法检测鱼类CO I基因的引物组，包括以下两对引物:第一对引物Cl:上游引物Cl-F的碱基序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物Cl-R的喊基序列如SEQ ID N0.2所不；第二对引物C2:上游引物C2-F的碱基序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物C2-R的喊基序列如SEQ ID N0.4所不。一种巢式PCR法检测鱼类CO I基因的方法，包括以下步骤:步骤一、提取目标鱼类基因组DNA ;步骤二、第一轮PCR扩增:以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用第一对引物Cl经PCR第一轮扩增得到第一轮扩增产物；步骤三、第二轮PCR扩增:以第一轮扩增产物为模板，采用第二对引物C2经PCR第二轮扩增得到第二轮扩增产物；步骤四、PCR扩增产物检测:取5 yL第二轮扩增产物，加入I UL的6 X LoadingBuffer,混勾后于1.5%琼脂糖凝胶中，EB浓度为5 μ g/mL，10V电压下电泳30min，凝胶成像系统观察并拍照；将阳性结果测序，并将测序结果进行Blast比对。作为实施例的优选方式，所述步骤一提取目标鱼类基因组DNA的方法具体如下:首先，取200mg鱼类肌肉放入1.5mL的离心管中，剪碎，加入TE缓冲液浸泡2?3h，期间换缓冲液3?4次，1000rpm离心5min去除上清；其次，加入500 μ L的TE缓冲液，再加入终浓度为I %的SDS和200 μ g/mL的蛋白酶K于55°C消化3?4h ;最后，消化物分别用等体积的饱和酚、酚:氯仿(I:1)、氯仿:异戊醇(24:1)抽提，然后加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠，2倍体积-20°C预冷的无水乙醇，混匀后置-20°C过夜，12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤2次，晾干，最后用200 μ L TE重新溶解，_20°C保存备用。作为实施例的优选方式，所述步骤二 PCR反应总体积为25 μ L，其中包含:超纯水 17.25 μ L、10 X PCR buffer 2.25 μ L、MgCl2 (50mM) 1.25 μ L、dNTPs 2 μ L、弓I 物Cl-F (0.0lmM) 0.5 μ L、引物 Cl-R(0.0lmM) 0.5 μ L、Taq 聚合酶 0.25 μ L 和基因组 DNA 模板Iμ L ；PCR反应循环为:起始变性95°C，2min ；35个循环，每循环包括95°C变性15s，60°C退火30s，每个循环退火温度降低0.50C ;72°C延伸50s ;最后72°C延伸10min，4°C保存；每次反应均设置阴性对照以检测是否存在污染；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。作为实施例的优选方式，所述步骤三PCR反应总体积为25 μ L，其中包含:超纯水 17.25 μ L、10 X PCR buffer 2.25 μ L、MgCl2 (50mM) 1.25 μ L、dNTPs 2 μ L、弓I 物Cl-F (0.0lmM) 0.5 μ L、引物 Cl-R (0.0lmM) 0.5 μ L、Taq 聚合酶 0.25 μ L 和第一轮扩增产物DNA模板IyL ;PCR反应循环为:起始变性98°C，2min ;35个循环，每循环包括95 °C变性15s，60°C退火30s，每个循环退火温度降低0.3°C;68°C延伸40s ;最后72°C延伸10min，4°C保存；每次反应均设置阴性对照以检测是否存在污染；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术具有以下有益效果:以鱼类的基因组DNA为模板，根据多种鱼类的CO I基因序列设计的特异性引物Cl-F和Cl-R、C2-F和C2-R，采用巢式PCR的方法，可以方便、特异的扩增出不同鱼类CO I基因，进而辅助鱼类分类、物种鉴定、隐存种的发掘、系统发生等研宄工作。【附图说明】图1为本专利技术第一轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M:marker ；1~7:本专利技术第一轮PCR扩增产物；8:阳性对照；9:阴性对照。图2为本专利技术第二轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M:marker ；1~7:本专利技术第二轮PCR扩增产物；8:阳性对照；9:阴性对照。【具体实施方式】实施例1引物设计通过比对多种鱼类CO I序列，设计出针对鱼类CO I基因的特异性引物C1-F、Cl-R、C2-F、C2-R，并利用软件Primer Premier5.0检验所设计的引物，同时扩增鱼类CO I基因的引物序列如下:Cl-F:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGT-3’Cl-R:5’-CAGGAAACAGCTATGACGCNAGTCAGCTAAANACTTT-3，C2-F:5’-CGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGTTAACAGCTAA-3’C2-R:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCC-3’实施例2检测方法1、鱼类基因组DNA提取:首先取200mg鱼类肌肉放入1.5mL的离心管中，剪碎，加入TE缓冲液浸泡2?3h，期间换缓冲液3?4次当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巢式PCR法检测鱼类CO Ⅰ基因的引物组，其特征在于：包括以下两对引物：第一对引物C1：上游引物C1‑F的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物C1‑R的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；第二对引物C2：上游引物C2‑F的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物C2‑R的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刑炳鹏，张稚兰，王彦国，林汝榕，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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