一种改造的琼胶酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种截短改造的琼胶酶，其是删除了野生琼胶酶C端的Por分泌系统C‑端分拣结构域(Por secretion system C‑terminal sorting domain)的同源片段而获得的截短琼胶酶，所述截短琼胶酶能催化琼胶底物产生新琼寡糖4、新琼寡糖6、新琼寡糖8、新琼寡糖10和新琼寡糖12；而所述野生琼胶酶只产生新琼寡糖4、新琼寡糖6。本发明专利技术所述改造的琼胶酶生产的多种聚合度新琼寡糖为反应终产物，在保湿性、抗氧化性方面比现有产品有明显提高。

【技术实现步骤摘要】
一种改造的琼胶酶及其应用
本专利技术涉及酶工程领域，特别是涉及通过改造来改善酶学性能的
，具体涉及通过基因工程重组改造改善琼胶酶的琼胶降解活性和产物组成，还涉及所述改造的琼胶酶及其产物的用途。
技术介绍
琼脂糖是一类大分子多糖，由其降解而来的新琼寡糖具有保湿、抗氧化、抗炎等重要的生物活性(问莉莉,董静静,李思东.琼胶寡糖的制备及其应用研究进展[J].山东化工,2011,40(5):28-30.)。根据聚合度不同，新琼寡糖可分为新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖、新琼十糖等。根据文献报道，高聚合度的新琼寡糖在美白、保湿、抗氧化等方面的活性要优于低聚合度的新琼寡糖，而低聚合度的新琼寡糖具有更好的细胞透过性，在药品领域有更大的应用潜力(HongSJ,LeeJH,KimEJ,etal.Invitro,andinvivo,investigationforbiologicalactivitiesofneoagarooligosaccharidespreparedbyhydrolyzingagarwithβ-agarase[J].Biotechnology&BioprocessEngineering,2017,22(4):489-496.)。因此，生产获得聚合度多样的新琼寡糖十分重要。酸水解法曾被广泛用于琼脂糖水解并生产相关寡糖，但该方法会对环境造成严重污染。琼胶酶是一类可以将琼脂糖降解为新琼寡糖的水解酶(朱磊,薛永常.琼胶酶酶学研究进展[J].生命的化学,2016(2):193-197.)，可用于生产新琼寡糖。琼胶酶酶解法相对于酸水解法具有产物专一、条件温和、环境友好等优势，是替代酸水解生产新琼寡糖的另一种方法。但是目前为止，利用琼胶酶降解琼脂糖产生的新琼寡糖的聚合度均较低，多为2-6糖(XiaoTF,SangMK.Agarase:ReviewofMajorSources,Categories,PurificationMethod,EnzymeCharacteristicsandApplications[J].MarineDrugs,2010,8(1):200-218.)。近些年的报道表明，通过重组酶生产新琼寡糖的方法获得的琼胶降解产物几乎仅有新琼四糖和新琼六糖(HouY,ChenX,ChanZ,etal.ExpressionandcharacterizationofathermostableandpH-stableβ-agaraseencodedbyanewgenefromFlammeovirgapacifica,WPAGA1[J].ProcessBiochemistry,2015,50(7):1068-1075.)。目前仅有一种琼胶酶可以生产聚合度为8-12的新琼寡糖，但该酶无法大量获得低聚合度的新琼寡糖(XuSY,KanJ,HuZ,etal.QuantificationofNeoagaro-OligosaccharideProductionthroughEnzymaticHydrolysisandItsAnti-OxidantActivities.[J].Molecules,2018,23(6):1354.)。迄今为止，还没有可以同时生产即含有高聚合度新琼寡糖又含有低聚合度新琼寡糖的酶。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术摒弃了不断寻找新琼胶酶的技术路线，而是对已知的琼胶酶进行生物信息学分析、功能预测和结构改造。在大量研究的基础上意外发现删除Por分泌系统C-端分拣结构域(PorsecretionsystemC-terminalsortingdomain)同源片段的截短琼胶酶不仅能够降解琼胶，并且其降解产物中同时含有高聚合度新琼寡糖和低聚合度新琼寡糖。一方面，本专利技术提供一种改造的琼胶酶，其特征在于删除野生琼胶酶C端的Por分泌系统C-端分拣结构域(PorsecretionsystemC-terminalsortingdomain)的同源片段而获得的截短琼胶酶，所述截短琼胶酶能催化琼胶底物产生聚合度为4-12的新琼寡糖(包括新琼寡糖4、新琼寡糖6、新琼寡糖8、新琼寡糖10和新琼寡糖12)，所述野生琼胶酶只产生聚合度为4-6的新琼寡糖(包括新琼寡糖4和新琼寡糖6)。本专利技术所述改造的琼胶酶，其特征在于所述野生琼胶酶的编码基因如SEQIDNO:1所示。本专利技术所述改造的琼胶酶，其特征在于删除了所述野生琼胶酶C端的157个氨基酸。第二方面，本专利技术提供所述改造的琼胶酶的编码多核苷酸。本专利技术所述改造的琼胶酶的编码多核苷酸，其特征在于其序列如SEQIDNO:2所示。第三方面，本专利技术提供一种重组表达载体或宿主细胞，其包含本专利技术所述改造琼胶酶的编码多核苷酸。第四方面，本专利技术提供一种新琼寡糖的制备方法，其特征在于以本专利技术所述改造的琼胶酶降解琼胶底物产生新琼寡糖。本专利技术所述的新琼寡糖制备方法，其特征在于所述新琼寡糖的生产条件为：酶用量50U，琼脂糖浓度1％，反应温度50℃，反应时间10min，反应终产物新琼寡糖的聚合度为4-12。第五方面，本专利技术提供利用所述新琼寡糖制备方法制备的新琼寡糖，其特征在于包括新琼寡糖4、新琼寡糖6、新琼寡糖8、新琼寡糖10和新琼寡糖12。第六方面，本专利技术还提供本专利技术所述新琼寡糖制备方法制备的新琼寡糖的用途，其特征在于用于保湿和/或抗氧化。本专利技术所述新琼寡糖的用途，其特征在于，相对于现有技术其它方法制备的新琼寡糖，其在保湿、抗氧化、清除自由基的活性均有所提高。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下优点：(1)产物全面，工艺简单。本专利技术所述琼胶酶在一个反应体系中可同时大量制备聚合度为4-12范围内的全部新琼寡糖，解决了现有技术中琼胶过度降解导致难以获得高聚合度新琼寡糖的技术问题，同时也避免了低聚合度新琼寡糖和高聚合度新琼寡糖分步生产后混合导致的繁杂工艺。(2)控制方便，组分稳定。本专利技术所述琼胶酶生产的新琼寡糖为反应终产物，无需精确控制反应的进行程度，产物中各聚合度新琼寡糖的组分相对稳定，在工业生产中更易控制，对生产设备、生产工艺、控制精确度的要求较低。(3)优化条件，利用率高。本专利技术对反应条件进行优化提高了底物利用率，保证95％以上的琼胶都被利用，因此避免了底物浪费和因未反应的琼胶固化后带来的设备堵塞的问题，更适合大规模的工业生产。(4)产品性能，效果优异。本专利技术所述方法制备的同时包含多种聚合度新琼寡糖产品，在保湿性、抗氧化性等方面均比目前酶法制备的新琼寡糖有了明显的提高。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：图1：rAgaM1-01纯化电泳图图2：新琼寡糖生产条件的优化A：琼胶底物浓度的优化，SUR为底物利用率，OD550为还原糖在波长550nm下的吸光值；B：反应时间的优化图3：薄层层析检测琼胶酶降解产物A：野生琼胶酶AgaM1的降解产物；B：改造琼胶酶AgaM1-01的降解产物图4：改造琼胶酶AgaM1-01降解产物与野生琼胶酶AgaM1降解产物40％浓度保湿性能对比图5：改造琼胶酶AgaM1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改造的琼胶酶，其特征在于删除野生琼胶酶C端的Por分泌系统C‑端分拣结构域(Por secretion system C‑terminal sorting domain)的同源片段而获得的截短琼胶酶，所述截短琼胶酶能催化琼胶底物产生聚合度为4‑12的新琼寡糖，所述野生琼胶酶只产生聚合度为4‑6的新琼寡糖。

【技术特征摘要】
1.一种改造的琼胶酶，其特征在于删除野生琼胶酶C端的Por分泌系统C-端分拣结构域(PorsecretionsystemC-terminalsortingdomain)的同源片段而获得的截短琼胶酶，所述截短琼胶酶能催化琼胶底物产生聚合度为4-12的新琼寡糖，所述野生琼胶酶只产生聚合度为4-6的新琼寡糖。2.如权利要求1所述改造的琼胶酶，其特征在于所述野生琼胶酶的编码基因如SEQIDNO:1所示。3.如权利要求2所述改造的琼胶酶，其特征在于删除了所述野生琼胶酶C端的157个氨基酸。4.权利要求1-3所述改造的琼胶酶的编码多核苷酸。5.如权利要求4所述编码多核苷酸，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾润颖，曲武，产竹华，陈兴麟，易志伟，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35