乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法技术

本发明专利技术涉及医学技术领域，尤其涉及乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法。本发明专利技术提供的引物和探针配合使用能够具有良好的重复性和灵敏度。实验表明，本发明专利技术提供的探针和引物对对浓度为2IU/mL的样本的检出率可达96％。对三个浓度的临床样本的变异系数(CV％)均小于5％。

Digital PCR detection probe, primer pair and detection method for hepatitis B virus

The invention relates to the technical field of medicine, in particular to a digital PCR detection probe, a primer pair and a detection method for hepatitis B virus. The primer and probe provided by the invention can be used with good repeatability and sensitivity. The experimental results show that the detection rate of the probe and primer for the sample with the concentration of 2IU/mL is 96%. The coefficient of variation (CV%) of three clinical samples was less than 5%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学
，尤其涉及乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法。
技术介绍
乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。HBV是目前人类感染的最小双链DNA病毒，不同病毒株的负链转录物均含有4个开放读码框(openreadingframe，ORF)，分别称为s、c、p、x。有研究表明HBVx基因序列高度保守，具有反式激活作用，当其与宿主细胞整合后，会导致正常细胞DNA片段缺失及染色体重排。HBVx基因编码的HBxAg是HBV的复制指标，与乙肝病毒的致病性和致癌性密切相关。数字PCR(DigitalPCR-dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，完全不依赖于Ct，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；此外数字PCR采用绝对定量的方式，且不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性，使dPCR迅速得到广泛的应用，这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异分析方面展现出的优势已被普遍认可。为了进一步提高乙型肝炎病毒检测的灵敏性和重复性，开发能够用于dPCR的乙型肝炎病毒检测方法，具有十分重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法。本专利技术提供的引物和探针配合使用能够具有良好的重复性和灵敏度。本专利技术提供的乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术提供的5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团。本专利技术提供的荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ。本专利技术提供的乙型肝炎病毒的数字PCR检测引物对，包括：SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物，和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物。本专利技术提供的引物和探针针对HBV的保守区，X区设计。实验表明，采用本专利技术提供的引物和探针能够实现对HBV病毒进行dPCR检测，待测样品种类可为乳汁或血清。灵敏度实验检测结果表明，本专利技术提供的探针和引物对对浓度为2IU/mL的样本的检出率可达96％。重复性检测则表明，该引物和探针对高中低三个浓度的临床样本的变异系数(CV％)均小于5％。说明本专利技术提供的引物和探针具有良好的灵敏度和重复性。本专利技术还提供了乙型肝炎病毒的数字PCR检测的试剂盒，其包括：SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探针；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物；和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物。本专利技术提供的试剂盒还包括数字PCR反应缓冲液。数字PCR反应缓冲液为2×数字PCR反应缓冲液，购自BIORAD，商品号为1863024。本专利技术提供的试剂盒还包括EP管，微滴发生卡和去离子水。本专利技术还提供了乙型肝炎病毒的数字PCR检测方法，包括：以待测样品的DNA为模板，在SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探针、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物、和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物存在条件下，经预扩增和数字PCR扩增后，根据读数判断样本中乙型肝炎病毒的存在情况。本专利技术中，待测样品为血清或乳汁。所述与扩增的反应体系体积为20μL，包括：本专利技术中，预扩增的反应条件为：本专利技术中，数字PCR扩增的反应条件为：本专利技术提供了乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法。本专利技术提供的引物和探针配合使用能够具有良好的重复性和灵敏度。实验表明，本专利技术提供的探针和引物对对浓度为2IU/mL的样本的检出率可达96％。对三个浓度的临床样本的变异系数(CV％)均小于5％。附图说明图1示微滴荧光分布散点图；图2示图1的定量检测结果图，即本专利技术试剂盒检测DNA样品的线性回归直线。具体实施方式本专利技术提供了乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针、引物对及检测方法。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。HBV全基因组质粒和HBV质控品及定量校准品HBV全基因组质粒：人工构建，含HBVC基因型的全长序列，使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适的浓度。HBV质控品及定量校准品：HBV阴性对照：市售阴性且外观澄清的血浆HBV临界阳性质控品：使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在1～100IU。HBV强阳性质控品：使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在104～105IU。HBV定量校准品：使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度在1～105之间，每个定量标准品浓度值相差10倍。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1灵敏度检测HBV全基因组质粒用阴性血浆稀释至浓度为200IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、25IU/ml、10IU/ml、5IU/ml、2IU/ml、1IU/ml(IU/ml表示每毫升所含病毒的量)。血清DNA的提取纯化采用QIAGEN的QIAampDNAMiniKit(Cat.51304)进行制备。使用QIAGEN的QIAampDNAMiniKit提取纯化待检样本、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品和定量校准品中的核酸。具体步骤如下：1)、在1.5ml离心管中加入20ul蛋白酶K。2)、在1.5ml离心管中加入200ul样本。3)、加入200ulAL缓冲液，振荡混匀15秒。4)、56℃温育10分钟。5)、短暂离心，收集管盖上的液体。6)、加入200ul无水乙醇，振荡混匀15秒并短暂离心。7)、将液体转移到离心柱中，8000rpm离心1分钟；将离心柱转移到一个8)、新的2ml收集管中，丢弃废液。9)、在离心柱中加入500ulAW1缓冲液，8000rpm离心1分钟；将离心柱转移到一个新的2ml收集管中，丢弃废液。10)、在离心柱中加入500ulAW2缓冲液，14000rpm离心3分钟；将离心柱转移到一个新的2ml收集管中，丢弃废液。11)、14000rmp离心1分钟。12)、将离心柱转移到一个新的1.5ml离心管中，丢弃废液。加入50ulAE缓冲液，室温静置5分钟，8000rpm离心1分钟，收集纯化好的DNA。做好标记，得到的DNA样本在4度保存备用。使用本专利技术探针和引物对，通过对每个浓度梯度重复检测25次。确定在各标准浓度下本专利技术试剂盒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.乙型肝炎病毒的数字PCR检测探针，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，其5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团。3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ。4.乙型肝炎病毒的数字PCR检测引物对，包括：SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物，和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物。5.乙型肝炎病毒的数字PCR检测的试剂盒，其包括：SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探针；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物；和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物。6.根据权利要求3所述的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤慧，胡鹏，任红，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50