一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针技术

本发明专利技术提供了一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针。该方法包括以下步骤：(1)设计引物和探针：P53上下游引物序列和P53探针序列分别见SEQ ID No:1、2和3；Claudin‑4上下游引物序列和Claudin‑4探针序列分别见SEQ ID No:4、5和6；(2)提取胰腺组织总RNA；(3)RNA浓度及纯度鉴定；(4)去除DNA；(5)real‑time PCR。通过设计特异性引物和探针，优化多重PCR条件，建立利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，该方法特异性好，灵敏度高，结果数据可靠，重复性强，与单个检测相比，可节约成本和时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤标记物的检测方法
，具体涉及一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针。
技术介绍
胰腺癌是一种高度恶化的消化系统肿瘤，临床表现无特异性，虽然近20年来医疗技术有了很大提高，但在诊断和治疗胰腺癌方面仍存在很多问题：早期的确诊率不高，手术死亡率较高，治愈率很低，我国胰腺癌的发病率位于常见肿瘤的第10位，致死率位居第4位。虽然胰腺癌患者的血清中含有较多的肿瘤标记物，如CAl9-9和CA242，以及癌胚抗原(CEA)等，但是现阶段血清学肿瘤标记物检测的灵敏度及特异性尚未尽如人意，故临床急需有效的联合检测以提高胰腺癌早期诊断率，改善整体治疗效果。胰腺癌基因肿瘤标记物可作为血清学肿瘤标记物的有效补充。上皮细胞间紧密连接骨架蛋白(Claudin)是细胞间紧密连接蛋白的主要结构之一，其表达具有组织特异性，在维持细胞急性和紧密连接屏障功能方面起着重要作用。紧密连接蛋白(Claudin)属于跨膜紧密连接蛋白，两个相邻的Claudin相互作用构成了细胞间的连接骨架，其完整性的破坏可引起细胞问黏附的丢失和肿瘤的扩散转移。有研究者发现Claudin中的主要成员Claudin-4在PanIN、原发性PDAC和侵袭性PDAC中高表达，而在正常胰腺导管上皮中低表达。还有一些研究者发现Claudin-4在癌组织中表达的阳性率明显高于胰腺正常组织，与胰腺炎相比，其表达与胰腺癌显著相关。有研究者使用4992个人类基因cDNA微阵列分析胰腺肿瘤，发现Claudin-4等基因上调，这为胰腺癌的早期诊断和良恶性胰腺病变的鉴别提供了可能。P53是肿瘤抑制基因，P53突变后细胞容易带着受损的DNA进入S期，使细胞遗传不稳定而产生突变和染色体畸变，导致细胞恶性变。有报导称50％～60％胰腺癌中存在突变型P53的过表达。胰腺癌关系最密切的抑癌基因为P53基因，约60％～80％的胰腺侵袭性肿瘤中发现该基因的失活，抑制细胞的凋亡并导致细胞的过度生长，且该基因在慢性胰腺炎中通常为阴性。P53突变在胰腺癌的发生过程中是具有高度特异性的肿瘤标志物。多重PCR即是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂盒操作过程与一般PCR相同。但由于多重PCR实验设计较一般PCR设计难度更大，除了需要考虑到引物与模板的特异性结合，还需要考虑引物与引物之间、引物与探针、产物与产物等之间的碱基配对结合，故其引物序列的设计是成功的关键，除此之外，为保证每个基因都得到有效的扩增，必须反复优化实验条件，包括反应体系及反应条件。目前，未见利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物Claudin-4、P53和18sRNA的方法的报导。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针，可简便、快捷的检测胰腺癌肿瘤标记物。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，包括以下步骤：(1)设计引物和探针：根据检测基因Claudin-4和P53，选择18sRNA作为定量内参，使用BeaconDesigner7软件设计引物和探针序列；P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQIDNo:1)；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQIDNo:2)；P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQIDNo:3)；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQIDNo:4)；Claudin-4Reverseprimer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQIDNo:5)；Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQIDNo:6)；18sRNAForwardprimer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQIDNo:7)；18sRNAReverseprimer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’(SEQIDNo:8)；18sRNAprobe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2(SEQIDNo:9)；(2)提取胰腺组织总RNA，此处用试剂盒mirVanaTMmiRNAIsolationKit(AM1561，Ambion)进行操作，具体过程如下：采用液氮研磨的方式破碎胰腺组织，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混匀，得裂解体系，然后加入1/10倍裂解体系体积的miRNAHomogenateAdditive，冰上裂解10min，最后加入与裂解后溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接着于13500r/min离心5min，转移上清至新管，再加入1/3上清液体积的无水乙醇沉淀两次后过柱纯化得总RNA；(3)RNA浓度及纯度鉴定：用酶标仪测定RNA浓度，15％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳鉴定RNA完整性；(4)去除DNA以及合成cDNA，此处用试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(CodeNo.RR047A，TakaRa)进行操作，具体操作如下：总RNA经gDNAEraser处理去除基因组DNA，采用Randomprimer和OligodTPrimer混合的RTPrimer作为反转录引物，加入1.5μg总RNA，反应程序依次为37℃，15min，85℃，5s，具体过程按照PrimeScriptTMRTreagentKit说明书进行操作；(5)real-timePCR，此处用试剂盒SsoAdvancedTMUniversalProbesSupermix(bio-rad，1725282)进行操作，具体操作如下：根据步骤(1)中设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。进一步地，步骤(5)中荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括P53上下游引物各0.4μL、P53probe0.3μL、Claudin-4上下游引物各0.4μL、Claudin-4probe0.3μL、18sRNA上下游引物各0.3μL、18sRNAprobe0.2μL、DNA模板3μL，去离子水补至20μL。进一步地，步骤(5)中荧光定量PCR检测的扩增程序为扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性5s，61℃退火30s，共40个循环。利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的2种引物，该2种引物序列分别为：P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQIDNo:1)；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQIDNo:2)；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQIDNo:4)；Claudin-4Reverseprime本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计引物和探针：根据检测基因Claudin‑4和P53，选择18sRNA作为定量内参，使用Beacon Designer 7软件设计引物和探针序列；P53 Forward primer：5’‑CAAAAGTCTAGAGCCACC‑3’；P53 Reverse primer：5’‑AATGTTTCCTGACTCAGAG‑3’；P53 probe：5’FAM‑TCTGACTGCGGCTCCTCC‑3’DABCYL；Claudin‑4 Forward primer：5’‑GCCAGCAACTACGTGTAA‑3’；Claudin‑4 Reverse primer：5’‑CTCAGTCCAGGGAAGAAC‑3’；Claudin‑4 probe：5’HEX‑ACGGCTCCACTCTGTTCCTC‑3’DABCYL；18sRNA Forward primer：5’‑GCAGCTAGGAATAATGGA‑3’；18sRNA Reverse primer：5’‑GAATTTCACCTCTAGCGGCG‑3’；18sRNA probe：5’CY5‑CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC‑3’BHQ2；(2)提取胰腺组织总RNA：采用液氮研磨的方式破碎胰腺组织，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混匀，再加入裂解体系1/10倍体积的miRNA Homogenate Additive，冰上裂解10min，最后加入与裂解后溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接着于13500r/min离心5min，转移上清至新管，再加入1/3上清液体积的无水乙醇沉淀两次后过柱纯化得总RNA；(3)RNA浓度及纯度鉴定：用酶标仪测定RNA浓度，15％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳鉴定RNA完整性；(4)去除DNA以及合成cDNA：总RNA经gDNA Eraser处理去除基因组DNA，采用Random primer和Oligo dT Primer混合的RT Primer作为反转录引物，加入1.5μg总RNA进行反应，反应程序依次为37℃，15min，85℃，5s；(5)real‑time PCR：根据步骤(1)中设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。...

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计引物和探针：根据检测基因Claudin-4和P53，选择18sRNA作为定量内参，使用BeaconDesigner7软件设计引物和探针序列；P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’；P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’；Claudin-4Reverseprimer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’；Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL；18sRNAForwardprimer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’；18sRNAReverseprimer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’；18sRNAprobe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2；(2)提取胰腺组织总RNA：采用液氮研磨的方式破碎胰腺组织，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混匀，再加入裂解体系1/10倍体积的miRNAHomogenateAdditive，冰上裂解10min，最后加入与裂解后溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接着于13500r/min离心5min，转移上清至新管，再加入1/3上清液体积的无水乙醇沉淀两次后过柱纯化得总RNA；(3)RNA浓度及纯度鉴定：用酶标仪测定RNA浓度，15％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳鉴定RNA完整性；(4)去除DNA以及合成cDNA：总RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴思思，陈雪梅，丁雨，倪银芸，朱国念，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51