一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法技术

本发明专利技术提供了一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法，本发明专利技术的原位杂交探针Oligo‑442A01可用于标记大麦染色体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并对该核苷酸进行荧光标记用于构建探针。利用该探针与(AGG)

In situ hybridization probe and method for identification of barley chromosome group

The present invention provides a method and in situ hybridization probes on barley chromosome identification, in situ hybridization probe Oligo 442A01 of the invention can be used to mark the barley chromosome, the nucleotide sequence of SEQ ID NO.3 is shown, and the nucleotides were labeled with the fluorescent probe for construction. The probe is used with (AGG)

【技术实现步骤摘要】
一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法
本专利技术涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及大麦染色体原位杂交(FISH)过程中寡核苷酸的确定与应用，本专利技术还涉及利用本专利技术提供的寡核苷酸探针对大麦开展非变性荧光原位杂交(ND-FISH)反应体系的建立与对大麦染色体组鉴定的应用。
技术介绍
高等生物染色体复结构杂，在不同染色体区域存在大量的重复序列，基于这一特性，在分子细胞遗传学领域通常通过标记重复序列用于鉴定染色体。其是通过对重复序列进行荧光标记标记制备探针，使用染色体原位杂交方法分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。进一步地，染色体原位杂交方法在染色体工程育种中也起着至关重要的作用，染色体原位杂交方法是鉴定、区分特定物种基因组与染色体组最有效、直接的方法之一。目前，已经报道的大麦亚端粒探针仅有Hv01，其是通过扩增大麦基因组亚端粒重复序列而得到的(Schubertetal.ThePlantJournal1998,14:494)。然而，通过标记扩增目标序列流程复杂，耗时费力，且受多种因素影响使得标记效果往往不理想。尤其是在进行大量试验操作时，这一方法将在很大程度上影响试验进程与效果。同时，通过标记扩增目标序列开展染色体原位杂交实验的方法需要对目标材料染色体进行变性处理，不仅增加了试验流程，同时在处理过程中易对载玻片上的染色体位置产生位移。当前，ND-FISH技术逐步兴起，替代传统的FISH试验方法。其可通过设计合适的寡合苷酸探针，在不变性的条件下直接对目标材料染色体进行标记，极大地精简了实验步骤、缩短了试验时间，同时保证了试验效果。因此，提供一条能稳定标记大麦亚端粒区域的核苷酸探针将有助于解决当前原位杂交试验中标记大麦亚端粒区域所面临的困境。
技术实现思路
为克服现有技术上的不足，本专利技术提供一种能稳定标记大麦染色体组的寡核苷酸探针以及该探针结合其他寡核苷酸探针通过ND-FISH方法鉴定大麦染色体组的应用。基于以上目的，本专利技术根据Schubertetal.(ThePlantJournal1998,14:494)对大麦染色体亚端粒区的研究结果确定引物：上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用该引物对栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027全基因组DNA进行PCR扩增反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现其产物存在如图1所示的4条较亮条带。选取其250bp左右条带回收并构建质粒进行测序，结果显示，其序列长度为113-116bp，说明所回收的核苷酸中存在两个前后相连的相似性极高的片段。利用NCBI数据库对测序结果Baudin1进行序列比对分析，检测出其在一段全长为105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登录号为AC256248.1)上存在64个拷贝。将HV_Mba442-A01分成小片段后反复在NCBI数据库中与其自身比对，最终确定一段相对保守的全长为55bp的核苷酸用于探针制备，其碱基序列为：5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，命名为Oligo-442A01，合成该序列并对其进行荧光标记用于制备探针。本专利技术提供了上述寡核苷酸探针在ND-FISH方法中对大麦染色体标记方法及染色体组鉴定的应用。本专利技术的寡核苷酸探针可用于检测大麦材料染色体。本专利技术提供了上述寡核苷酸探针在ND-FISH方法中对大麦染色体组鉴定的应用，是用上述寡核苷酸探针与寡核苷酸探针(AGG)5组成的探针组合对大麦染色体开展ND-FISH试验，综合大麦染色体组的两种探针信号位点分布状况，若在荧光显微镜下能将大麦染色体组区分开，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)5的组合能用于鉴定大麦染色体组。本专利技术提供了检测大麦材料染色体的寡核苷酸探针，即Oligo-442A01，探针核苷酸序列为：5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’。(SEQIDNO.3)进一步地，提供了Oligo-442A01在检测大麦材料染色体的方法。本专利技术提供了Oligo-442A01探针在ND-FISH方法中的应用。本专利技术提供了Oligo-442A01探针在大麦种质资源改良中的应用。本专利技术提供了Oligo-442A01探针结合(AGG)5探针在ND-FISH方法中鉴定大麦材料染色体组的应用。本专利技术提供了一种寡核苷酸探针Oligo-442A01在ND-FISH方法中检测大麦材料染色体的方法，用寡核苷酸探针Oligo-442A01对大麦材料染色体开展ND-FISH试验，若在荧光显微镜下大麦部分区域表现出对应的信号，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01能用于ND-FISH方法中检测大麦材料染色体亚端粒区域。其中，所述ND-FISH方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加10μl(0.35μl1OD/mlOligo-442A01探针与9.65μl杂交液)混合杂交液，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH2O洗1次，滴加10μlDAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUSBX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUSDP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mMTris-HCl,0.5mMEDTA,0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠。本专利技术提供了上述方法在大麦细胞学检测中的应用。本专利技术提供了一种寡核苷酸探针Oligo-442A01与寡核苷酸探针(AGG)5组合在ND-FISH方法中鉴定大麦材料染色体组的应用，用寡核苷酸探针Oligo-442A01与寡核苷酸探针(AGG)5按一定比例浓度组合对大麦材料染色体开展ND-FISH试验，综合大麦染色体组的两种探针信号位点分布状况，若在荧光显微镜下能将大麦染色体组区分开，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)5的组合能用于鉴定大麦染色体组。其中，所述ND-FISH方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加10ul(0.35μl1OD/mlOligo-442A01探针、0.35μl1OD/ml(AGG)5探针与9.30μl杂交液)混合杂交液，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH2O洗1次，滴加10μlDAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUSBX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUSDP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mMTris-HCl,0.5mMEDTA,0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠。本专利技术所开发的ND-FISH方法中对大麦染色体进行标记的寡核苷酸探针，直接对大麦染色体进行检测，结果显示该探针能显著地标记于大麦染色体亚端粒区域。该方法不仅具有灵敏度高、检测效果较好的特点，同时还克服了传统的质粒标记方法所带来本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测大麦染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测大麦染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于，用荧光标记物标记该寡核苷酸探针。3.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在检测大麦染色体形态中的应用。4.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在大麦种质资源改良中的应用。5.一种采用荧光原位杂交检测大麦染色体的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的寡核苷酸探针对大麦材料进行ND-FISH检测，如果在荧光显微镜下大麦材料染色体上检测出信号，则说明该方法能用于检测大麦染色体。6.一种采用荧光原位杂交鉴定大麦染色体组的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的寡核苷酸探针与(AGG)5组成的探针组合对大麦材料进行ND-FISH方法检测，如果检测结果表明两两异源染色体信号分...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光登，胡德益，李廷轩，张锡洲，王永东，郑子成，余海英，康亮珠，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51