EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒，试剂盒包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19‑Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c。本发明专利技术的EGFR基因突变检测试剂盒可以快速、便捷、准确地检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针和检测产品，属于生物

技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌治疗的里程碑。但是几乎所有初始对EGFR-TKI反应良好的患者会在6-12个月内出现耐药、疾病进展，称为“获得性耐药”。许多研究已经证实EGFR的突变状态决定了肿瘤对EGFR-TKI的反应。因此治疗前进行EGFR突变检测筛选具备EGFR-TKIs治疗指征的患者，治疗中持续检测突变状态的变化，及时发现耐药突变改变治疗策略，对于EGFR-TKI的个体化治疗及预测预后有重要意义。表皮生长因子受体(EGFR)是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物是吉非替尼，主要通过抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，从而抑制肿瘤细胞的生长。EGFR的突变不同，病人对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感程度不同，19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R最为敏感。目前，EGFR基因突变最常见的来源是肿瘤的病例组织或细胞学标本，但是组织取材是有创伤的操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者等一般情况对的影响，有时不能取得满意的组织或者组织太少不能进行基因检测。随着疾病的研究进展，EGFR-TKIs耐药的出现，常常需要再次进行生物学检测，而组织取材为有创操作不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。目前研究表明血清/血浆/血浆中的游离DNA可以用于EGFR基因的检测，cfDNA用于肿瘤突变检测的优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中均可获取；可以作为一种肿瘤标志物，实现实时监测和动态检测；克服肿瘤组织的特异性。探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径，但是由于大多数人血清/血浆中cfDNA含量低，且cfDNA片段相对小等原因，目前对EGFR的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以快速、便捷、准确地检测EGFR基因突变的EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因突变检测引物探针，：包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。上述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L。上述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。上述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的引物探针的EGFR基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因突变检测试剂盒，包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；所述引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：包括用于检测19外显子E19‑Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。...

【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L。3.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。4.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。5.一种采用如权利要求1所述的引物探针的EGFR基因突变检测产品。6.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；所述引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31