一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测中国人HPFH和δβ‑地中海贫血的试剂盒及方法。该试剂盒包括如SEQ ID NO.1～8所示的引物。本发明专利技术能在一管反应中同时检测3种中国人常见的HPFH和δβ‑地中海贫血常见缺失类型：东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ‑地贫；整个检测体系只设计了一个共用的正常对照，从而使扩增体系更稳定可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种地中海贫血的基因诊断试剂盒和方法，特别涉及一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法。
技术介绍
地中海贫血(Thalassemia)，简称地贫，是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α-地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(β-地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国,是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万徵患与基因携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致死产，另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国甚至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。β-地中海贫是由于β珠蛋白链合成异常的一类地贫，重型β-地贫患儿因为在出生时与正常婴儿相同，一般在半岁左右出现进行性的加重性的贫血才被发现，后续就必须靠输血维持生命；而重型α地中海贫血(Bart's水肿胎)在妊娠中可以被超声影像发现，并往往在妊娠晚期流产或出生后数小时死亡。所以重型β-地贫具有更严重的危害性，对家庭和社会造成更为严重的后果。目前200多种引起β-地贫的突变被鉴定，其中大部分为点突变，而10％左右的突变为β-珠蛋白基因簇大片段缺失，这些缺失可能引起β0-地贫，(δβ)0-地贫，Gγ+(Aγδβ)0-地贫和遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditarypersistenceoffetalhemoglobin，HPFH)等。这些缺失如果结合其它β珠蛋白基因点突变可能导致重型β-地贫。由于现在临床用试剂盒未覆盖到这些缺失的检测，所以临床往往被漏诊，可能导致重型β-地贫患儿的出生，所以在地贫高危人群中要重视此类地贫的筛查和检测。目前国际常规的实验室诊断方法是血常规检测分析红细胞参数的基础上，对可疑人群直接进行基因检测，而国内常规做法是在血红蛋白电泳筛查的基础上，对可疑人群进行基因诊断，β地贫的基因诊断是应用PCR结合反向斑点膜杂交(RDB)的技术(简称PCR-RDB)进行。已有商品化的β地贫基因检测试剂盒只要覆盖到了上述的17种点突变，而没有包括HPFH和δβ-地中海贫血相关突变的检测。部分实验室只能自己建立检测HPFH和δβ-地中海贫血常见突变类型的方法，而在检测临床标本的时候各种可能的突变只能分开单独检测，费时费力、检测效率低。鉴于HPFH和δβ-地中海贫血在临床上漏诊可能导致严重的后果，应该高度重视此类地贫突变的检测，临床需要一种高效、准确的检测此类地贫的方法。珠蛋白基因测序虽然是诊断地贫的金标准，也是国外普遍应用于地贫基因诊断的方法，但不适用于基因大片段缺失的检测。一些基于PCR技术的方法如限制性内切酶(RE)、Southernblotting以及多重连接探针扩增(MLPA)等技术应用于了β珠蛋白基因簇未知和罕见型大片段缺失的检测。然而应用最广泛的是跨越断裂点PCR(Gap-PCR)技术，其原理是：引物与缺失序列的两侧翼序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引物之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段；另一条引物则位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常情况下，正常等位基因才会被扩增出来；该法可以准确检出大片段缺失突变，是目前最常用的针对己知缺失型突变的检测方法。1994年Craig等建立了九种单重Gap-PCR的方法，可以检测引起(δβ)0-地贫和HPFH的九种缺失，包括：HPFH-1，HPFH-2，HPFH-3，Spanish(δβ)0-地贫，HbLepore，Sicilian(δβ)0-地贫，中国型Gγ(Aγδβ)0-地贫，Asian-Indianinversion-缺失型Gγ(Aγδβ)0-地贫和Turkishinversion-缺失型(δβ)0-地贫等。该方法促进了这几种缺失型的分子诊断,但是只能进行单重检测，所以只能每种逐一地进行检测，费时费力。中国人群中导致HPFH和δβ-地贫的缺失型突变主要有3种，其中3种为Gγ(Aγδβ)0-地贫，分别为中国型和云南型，另一种为东南亚缺失HPFH。这三种突变目前还没有在一管中同时进行检测的相关报道，所以目前各实验室只能单独进行检测，费时费力，检测效率低。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，包括如表1所示的引物：表1PCR引物序列(均为5’-3’)表中的For表示上游引物，Rev表示下游引物；SEA表示东南亚HPFH，Yun表示云南型δβ-地贫，Chi表示中国型δβ-地贫，Nor表示正常对照。所述的试剂盒还包括用于PCR的酶、用于PCR的缓冲液、dNTP、甜菜碱和用于PCR的水中的一种或至少两种。优选地，所述的试剂盒包含含有上述引物的预混液，预混液的组成如下：SEAFor、SEARev、YunFor、YunRev、ChiFor、ChiRev、NorFor、NorRev、甜菜碱、dNTP、PCR反应缓冲液、用于PCR的酶。所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：SEAFor0.3μM、SEARev0.3μM、YunFor0.2μM、YunRev0.2μM、ChiFor0.3μM、ChiRev0.3μM、NorFor0.2μM、NorRev0.2μM、甜菜碱1M、dNTP0.8mM、1×PCR反应缓冲液、用于PCR的酶0.1U/μl。所述的用于PCR的酶优选为TaqDNA聚合酶。所述的用于PCR的水优选为双蒸水或超纯水。一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的方法，是采用上述试剂盒进行，包括如下步骤：(1)对待检测样本提取基因组DNA；(2)配制PCR反应体系；每25μl反应体系的组成如下：10×PCR反应缓冲液2.5μl、浓度为10mM的dNTP2μl、浓度为10μM的引物SEAFor0.75μl、浓度为10μM的引物SEARev0.75μl、浓度为10μM的引物YunFor0.50μl、浓度为10μM的引物YunRev0.50μl、浓度为10μM的引物ChiFor0.75μl、浓度为10μM的引物ChiRev0.75μl、浓度为10μM的引物NorFor0.50μl、浓度为10μM的引物NorRev0.50μl、浓度为5M的甜菜碱(betaine)5μl，浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl、浓度20～40ng/μl的基因组DNA1～2μl，用于PCR的水补足至25μl；(3)进行PCR扩增，PCR条件如下：95℃5min；95℃45s、56℃90s、72℃3min，10个循环；95℃45s、56℃45s、72本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测中国人HPFH和δβ‑地中海贫血的试剂盒，其特征在于包括如下引物：SEA For：5’‑TGCAGCAGTTGCCAACACAAG‑3’；SEA Rev：5’‑TTTCAAAAGCCTCATGGTAGC‑3’；Yun For：5’‑GGAGCTAGAGACAAGAAGGTA‑3’；Yun Rev：5’‑GCAGTTCTCCCTGGCCTTG‑3’；Chi For：5’‑ATATAAAATGCTGCTAATGCTTC‑3’；Chi Rev：5’‑CCCATTAAATGCAGGTAGTTGT‑3’；Nor For：5’‑TTGGCCAATCTACTCCCAGGAG‑3’；Nor Rev：5’‑TTCTCCTCAGGAGTCAGATGCAC‑3’。

【技术特征摘要】
2016.11.23 CN 20161103713651.一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于包括如下引物：SEAFor：5’-TGCAGCAGTTGCCAACACAAG-3’；SEARev：5’-TTTCAAAAGCCTCATGGTAGC-3’；YunFor：5’-GGAGCTAGAGACAAGAAGGTA-3’；YunRev：5’-GCAGTTCTCCCTGGCCTTG-3’；ChiFor：5’-ATATAAAATGCTGCTAATGCTTC-3’；ChiRev：5’-CCCATTAAATGCAGGTAGTTGT-3’；NorFor：5’-TTGGCCAATCTACTCCCAGGAG-3’；NorRev：5’-TTCTCCTCAGGAGTCAGATGCAC-3’。2.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：还包括用于PCR的酶、用于PCR的缓冲液、dNTP、甜菜碱和用于PCR的水中的一种或至少两种。3.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含所述的引物的预混液，预混液的组成如下：SEAFor、SEARev、YunFor、YunRev、ChiFor、ChiRev、NorFor、NorRev、甜菜碱、dNTP、PCR反应缓冲液、用于PCR的酶。4.根据权利要求3所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：SEAFor0.3μM、SEARev0.3μM、YunFor0.2μM、YunRev0.2μM、ChiFor0.3μM、ChiRev0.3μM、NorFor0.2μM、NorRev0.2μM、甜菜碱1M、dNTP0.8mM、1×PCR反应缓冲液、用于PCR的酶0.1U/μl。5.根据权利要求1～4任一项所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的用于PCR的酶为TaqDNA聚合酶。6.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的用于PCR的水为双蒸水或超纯水。7.一种检测中国人HPFH和δ...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆明勇，王继成，胡听听，秦丹卿，梁驹卿，张艳霞，袁腾龙，王奕霞，杜丽，尹爱华，
申请(专利权)人：广东省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广东;44