本发明专利技术涉及生物与医药技术领域，具体涉及一种在临床样本中快速香港型α-地中海贫血的基因检测试剂盒。本发明专利技术进一步确认了HKαα融合基因的基因序列，与α-globin序列进行比对分析，在融合基因的保守序列区域进行引物设计。本发明专利技术的技术方案为提供一种香港型α-地中海贫血的基因检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物HKαα-F和HKαα-R，所述引物为针对HKαα融合基因的保守序列区域进行引物设计的引物，所述HKαα融合基因的保守序列的核苷酸序列为：SEQ?ID?NO：1。本发明专利技术试剂盒可直接用于HKαα检测的试剂盒，能特异、快速、稳定的对HKαα基因型进行诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物与医药
，具体涉及一种在临床样本中快速检测香港型 α-地中海贫血(ΗΚα a )的试剂盒。
技术介绍
a -地中海贫血(Thalassemia，以下简称0-地贫)，是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非 α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。地贫是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区，90万人的流行病学调查得出的总发病率为2. 46%，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为 14. 95%,4. 11%,2. 60%、I. 92% 和 I. 20%。人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，每条染色体各有2个珠蛋基因。大多数α-地贫是由于α-珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一个Ct-基因缺失或缺陷，则α -链的合成部分受抑制，称为α +地贫；若有一条染色体上的2个α-基因均缺失或缺陷，称为Cici地贫。重型α -地贫是α 0地贫的纯合子状态，其4个α -珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α-链生成，因而含有α-链的Hh A、Hb A2和HbF的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量Y链合成Y4(Hb Bart' S)。Hb Bart' s对氧的亲合力极高,造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合症。中间型和α-地贫是0°和α +地贫的杂合子状态，是由3个α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α-链，其多余的β链即合成Hb Η(β4)。Hb H对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短。标准型α -地贫(轻型)是α +地贫纯合子或α °地贫杂合子状态，它仅有2个α -珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α -链合成，病理生理改变轻微。静止型α-地贫是α +地贫杂合子状态，它仅有一个α-基因缺失或缺陷， α-链的合成略为减少，病理生理改变非常轻微。根据α基因突变类型分类，地贫主要包括缺失型α-地贫(DNA片段缺失)、突变型α-地贫(点突变)。我国最常见的缺失类型为-a3_7、-a42、--SEA 3种。随着α-地中海贫血机制的进一步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现“列如--11·1、-^2·4、-^7、一 、一^、!!!^ α 等。目前，HKa α地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展HKa α的检测提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。但目前尚未有直接检测HK a α的产品。目前对α-地贫筛查方法主要有血常规测定、红细胞脆性检测、血红蛋白电泳等， 这些方法只能对患者进行初步的地贫筛查，无法对患者基因型进行确诊，容易对轻型地贫漏诊。随着技术的发展，出了地贫基因诊断的方法，主要包括以下几种=Southern杂交、多重Gap-PCR、多重连接酶依赖探针扩增技术(MLPA)、PCR-寡核苷酸探针(ASO)法、实时荧光定量PCR、斑点杂交、直接测序技术等。各种基因诊断技术特点如下I、Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法曾是α -地贫基因诊断的主要方法， 但由于操作繁琐，所需时间较长，一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用。2、依赖探针连接扩增技术(MLPA) :MLPA是2002年发展起来的，该方法能对所有的缺失基因型检测以及未知的基因型开展检测，具有高效、特异，在同一反应管内检测多达45 个不同核酸序列拷贝数变化；常用于α缺失基因的检测，但由于检测成本高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不便于分子筛查方法的推广应用。3、测序技术测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准； 目前测序技术面临着标本的处理(核酸提取)扩增标准化认证问题，信号检测、测序平台特异的出错和纠错问题，以及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用。4、反向斑点杂交(Reverse Dot Blot, RDB)法这一方法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点，目前已广泛应用于β_地贫的临床产前诊断和基因诊断。主要原理将大量寡核苷酸作为探针固定于固相支持物上，借助碱基互补，与经PCR扩增、与生物素标记的样本靶分子进行杂交，经化学显色给出杂交信号，通过计算机分析获得信息。这种方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检测。5、Gap-PCR及其改进的技术由于其易操作，此技术广泛用于缺失地贫的分子诊断，在缺失区域两端设计一对引物，正常情况下两引物扩增产物很长不属于扩增的范围，而出现缺失区域的时候能出现特异性的扩增。1990年Lebo等应用PCR技术检测α -地中海贫血I，Dode和Baysal等应用PCR技术检测α -地中海贫血2。目前市场上以Gap-PCR开发的试剂盒只能检中国最常见的3种缺型-α3_7、-α42和一SEA，而不能检测ΗΚα α等非常见的基因型。6、实时荧光定量PCR (Taqman探针法)实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测 PCR进程及连续分析扩增相关的荧光信号，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在地中海贫血检测中，报道的均只局限于一种基因型的检测，工作量大，由于探针需要进行荧光标记，检测成本高。7,PCR-寡核苷酸探针(ASO)法这一技术可快速简便地检测已知突变的地贫基因 (^^和βτ)，具有很高的灵敏性和准确性，但一次杂交只能检测一种突变，而且还需要同位素探针，难以推广应用。尽管检测地贫的方法和产品很多，但是目前尚未有直接检测ΗΚα α的产品。现有α -地中海贫血检测及其缺点I、目前我国临床应用的检测缺失型α地贫的试剂盒均是基于多重Gap-PCR原理开发的，可以在同一 PCR体系中对多种缺失地贫基因型(一SEA、-α3 7、-α4 2)的检测，如亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因公司各自开发的 α -地中海贫血检测试剂盒，这些产品均只能检测3种常见的缺失型地贫。2、潮州凯普生物化学有限公司利用PCR与反向点杂交法结合开发的α，β _地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒，除检测一SEA、-α3·7,-α4·2三种缺失型α -地贫外，增加了 2种突变基因型(aesa、aQSa )的检测。HKa α不在其检测的范围内。3、现有a -地中海贫血检测产品专利技术中，未见直接针对HKa α的检测。4、目前HK a α地贫的检测均是根据临床表型，借助现有地贫检测试剂盒结合父母基因型的遗传分析实现的，没有一种快速、直接的用于检测HKa α地贫的方法。
技术实现思路
本专利技术进一步确认了 HKa α融合基因的基因序列，与a-globin序列进行比对分析，在融合基因的保守序列区域进行引物设计。进一步通过体系及反应程序的优化，最终确定优选的引物组合、体系中各组分最终的浓度以及PCR扩增的最优程序，实现HKa α特异性扩增。本专利技术的技术方案为提供一种香港型α-地中海贫血的基因检测试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香港型α？地中海贫血的基因检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物HKαα？F和HKαα？R，所述引物为针对HKαα融合基因的保守序列区域进行引物设计的引物，所述HKαα融合基因的保守序列的核苷酸序列为：SEQ？ID？NO：1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁少明，李长远，刘晶晶，任维，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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