用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示其反应结果的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。以LAMP反应为例，用熔点为40-60℃的全精炼石蜡或半精炼石蜡，利用其在LAMP反应温度（60-65℃）时为液态，反应结束后冷却至室温又恢复为固态的原理来防止污染。可通过浊度来判断结果，或通过指示剂来指示恒温扩增反应结果。本发明专利技术采用容易配制的特殊熔点蜡块，价格低廉，固态封闭效果好，可永久封闭，从而避免了扩增物受到污染，有效防止核酸恒温扩增反应结果的假阳性，适用于所有核酸恒温扩增反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。
技术介绍
核酸恒温扩增方法目前主要包括以下几种环介导恒温扩增(loop -mediated isothermal amplification, LAMP)、切口酶核酸恒温扩增(nicking enzymemediated amplification, NEMA)、链替代扩增(strand displacement amplification,SDA)、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)、依赖解旋酶的恒温基因扩增(helicase — dependent isothermal DNA amplification, HAD)、转录依赖的扩增系统(transcription 一 based amplification system, TAS)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)又称自主序列复制系统(self — sustained sequence replication, 3SR)、QB 复制酶扩增(Q —beta replicase — amplified assay)等。恒温扩增摆脱了热循环的限制,使其应用范围大大增加，而且目前应用的恒温扩增方法都有较高的敏感性和特异性，在核酸检测中应用范围非常广。但敏感性高会带来扩增物污染和假阳性的问题，从而导致反应结果判读不准确。其中，环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、特异、敏感的核酸检测方法，再加之其操作简单，不需要昂贵复杂的仪器，近十多年发展迅速，广泛应用于基因检测的各个领域。虽然LAMP技术已日趋成熟，但将其真正应用到病原微生物实际临床检测或检疫单位检测病原微生物的实例却少之又少，大多都局限于实验室内的基因筛查，究其主要原因，就是假阳性的问题，也就是扩增产物污染不可控。因为LAMP具有非常高的敏感性，任何一点扩增物的溢出都将给LAMP实验带来不可控的污染问题，因此，迫切需要一种用于环介导恒温扩增技术(LAMP)中防止核酸污染和指示反应结果的方法。
技术实现思路
为解决现有核酸恒温扩增反应中扩增物易污染和易产生假阳性导致结果判读不准确的问题，本专利技术的目的是提供一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。本专利技术所提供的用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法，是将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25°C、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石腊块加入到反应管中反应液的上方，然后盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应温度下全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块融化成为液态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后冷却至室温液态石蜡又恢复为固态，最后用浊度仪对反应液进行结果判读，在整个反应过程中反应液始终与外界隔离，可达到防止核酸污染和避免结果假阳性的目的。所述防止核酸污染的方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，本专利技术防止核酸污染的方法包括以下步骤I)将熔点为40_60°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应温度下固态石腊块融化成为液态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，冷却至室温，待液态石蜡恢复为固态后用浊度仪进行结果判读。 本专利技术所提供的用于核酸恒温扩增反应中指示反应结果的方法，具体为用于核酸恒温扩增反应中用指示剂进行结果判读并可避免指示剂抑制反应的方法，是将熔点高于核酸恒温扩增反应温度5-25°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，降温后制成直径与反应管管径相同的柱状固态石蜡块，然后将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应过程中固态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后将温度升高至固态石腊的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。所述方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。所述指示剂包括钙黄绿素、羟基萘芬兰、溴化乙锭、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，所述用指示剂进行结果判读的方法包括以下步骤I)将熔点为70_85°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应过程中固态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。环介导恒温扩增技术(LAMP)中，所述指示剂为钙黄绿素或羟基萘芬兰。本专利技术提供了一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法，并以LAMP反应为例进行了说明。用于LAMP反应中防止核酸污染的方法是采用熔点为40-600C的全精炼石蜡或半精炼石蜡，利用其在LAMP反应温度(60_65°C )时为液态，反应结束后冷却至室温又恢复为固态的原理来防止污染。如果通过浊度来判断结果则不需要加指示剂，如果通过指示剂来指示反应结果且使指示剂(例如钙黄绿素、羟基萘芬兰等)不抑制恒温扩增反应便可以将抑制LAMP反应的指示剂放入熔点为70°C _85°C的全精炼石蜡或半精炼石蜡中，待恒温扩增反应结束后再将温度升至石蜡熔点使石蜡融化，指示剂释放便可以指示恒温扩增反应结果。本专利技术具有以下优点I)特殊熔点蜡块容易配制，价格低廉；2)固态封闭效果好，可永久封闭，从而避免了扩增物受到污染，液 态封闭剂如果口打开后仍能造成污染；3)该方法可以有效防止核酸恒温扩增反应结果的假阳性；4)对核酸恒温扩增反应无任何影响；5)应用此方法可以不用严格的实验分区，反应区和加样区可以合二为一；6)应用范围广，本专利技术适用于所有核酸恒温扩增反应。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法，是将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0？25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块加入到反应管中反应液的上方，然后盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应温度下全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块融化成为液态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后冷却至室温液态石蜡又恢复为固态，最后用浊度仪对反应液进行结果判读，在整个反应过程中反应液始终与外界隔离，可达到防止核酸污染和避免结果假阳性的目的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁静，刘威，黄留玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：