本发明专利技术涉及一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，属于功能高分子领域。该方法的过程包括将聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯荧光共聚物经卤代烷质子化制成带有正电荷的聚电解质，并将这种聚电解质与直链或者发卡结构的DNA作用形成新型荧光探针来检测目标DNA的方法。该方法的优点在于：是一种制备简单、操作简易、行之有效的新型荧光探针，将为稳定、高效、特异性识别核酸分子开辟一种新途径并在揭示疾病与基因变异等方面具有重要的科学意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，特别是涉及一种利用非共轭荧光共聚物与直链或者发卡结构的DNA通过静电作用形成新型的分子探针来检测目标DNA的方法，属于功能高分子
技术介绍
功能高分子在生物医学领域中的应用，特别是荧光高分子在分析、检测生物大分子方面的研究已引起国内外科学工作者的密切关注，此研究方向也是国际上前沿科学的研究热点。一些小分子荧光染料如吖啶、菲啶类染料、菁类染料、荧光素和罗丹明类染料、噻嗪和噁嗪类染料等是目前应用较广的核酸荧光探针，这些简单的荧光染料对核酸分子的序列不能特异识别，属于非特异性的小分子探针。为了克服上述不足，科学工作者将荧光基团通过共价键连结到单链寡聚核酸分子上，例如Saito、Hrdlicka等人分别设计了一种芘标记到核酸上的线性荧光探针，发现这种荧光标记的分子探针与碱基序列互补的核酸分子通过Watson-Crick碱基配对法则形成杂化复链,祀向杂化前后的突光性能发生重大变化，从而实现了荧光探针特异性识别核酸分子(J. Am. Chem. Soc.，2004, 126，4820 ；Chem.Commun. , 2010, 46, 4929)。Wang等人也设计了一种花标记HNA及RNA线性探针，发现革巴向杂化后芘单体的荧光强度增加而激基复合物的荧光强度剧烈下降，从而实现对目标分子的检测(ChemBioChem.，2009，10，1175)。然而相对于线性的分子探针，它是一种茎端有一对荧光基团和淬灭集团修饰的发卡结构的分子探针，也称为分子信标，具有一些关键的优点提高错配目标的热识别及降低假阳性信号的风险。因而在生物研究领域受到更为广泛的关注。Tan等人在分子信标的设计及应用方面做出了很多杰出的成果，包括生物传感器的设计、核酸的检测及生命系统的监测等等(J. Am. Chem. Soc.，2008, 130, 8351. ；Angew.Chem. , 2001, 113, 416;Angew. Chem. Int. Ed. , 2001, 40, 402. ；Anal. Chem. , 2005, 77, 4713)。然而，研究结果表明标记型荧光探针检测核酸分子的缺点在于荧光基团的引入会降低荧光探针与靶向分子杂化双链的热稳定性，从而会降低荧光探针的检测精度；标记型荧光探针需要将荧光基团通过共价键连结到寡聚核酸分子链上以实现特异性识别核酸分子，而其中的合成与操作较繁杂。近几年，水溶性的荧光共轭聚电解质作为非标记性的荧光探针荧光在生物传感应用领域上得到越来越多的研究者的亲睐。He等人报道了一种用共轭聚电解质制备的非标记型的多路复用的DNA探针来检测DNA杂交时信号的转输(J. Am. Chem.Soc.，2009, 131，3432)。Bazan等人通过用一种水溶性的阳离子共轭聚电解质设计均质的荧光探针(Chem. Mater.，2004, 16，4467)。王树等人也报道了一种充分利用分子信标在错配识别的优势及共轭聚电解质较高的量子产率的性质而制备的检测DNA的分子探针，以及还报道了用包含有共轭聚电解质的荧光胶束检测DNA和酶等等(Langmuir.，2008, 24，12138 ；Langmuir.，2009，25，13737 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2009，48，5316)。这些荧光共轭聚电解质可通过静电作用与生物大分子结合，通过荧光共振能量转移FRET或电子转移、分析物诱导荧光高分子聚集态结构变化、分析物诱导荧光高分子构象变化等可导致这种荧光高分子的光学性能改变，进而对生物大分子进行检测。虽然共轭聚电解质有广泛地应用为生物传感器的材料，但非共轭荧光聚电解质作为生物传感器材料尚未见报道。本专利专利技术了一种新的非标记的荧光聚电解质，将其通过静电作用与DNA形成一种新型的非标记的荧光探针，这种荧光聚合物克服了小分子荧光探针的非特异性识别及标记性荧光探针的制备繁杂等缺点，为生物大分子的检测开辟了一种新的测试方法。申请人:申请的为一种利用丙烯酸芘甲酯制备水溶性共聚物的方法，申请号201110430560. 7的专利申请，公开了未质子化之前的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的合成方法，本申请在此全文引用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种合成方法简单，且含有突光量子产率较高的花突光基团的非共轭聚电解质，通过静电作用结合直链或者发卡结构的DNA形成新型的分子探针来 检测目标DNA的方法。本专利技术特点在于利用非共轭聚电解质与DNA结合，形成新型的分子探针，该非共轭聚电解质合成路线简单易行，所合成的聚合物的侧链上引入了荧光量子产率较高的且对周围环境有很强的敏感性的芘荧光基团和亲水性的胺基基团，使该聚电解质能很好地应用于生物等方面的检测。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物经卤代烷质子化制成带正电荷的含芘荧光基团的聚电解质，并将这种聚电解质与直链或者发卡结构的单链DNA作用形成新型荧光探针来检测目标DNA。一种用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，按照下述步骤进行( I)共聚物质子化的反应将聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物和适量的碘甲烷按物质的量为1:3溶于有机溶剂四氢呋喃中,在常温下反应24小时。反应结束后,将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将最终的荧光聚电解质在真空干燥箱中以70°C温度干燥12小时，合成路线如图I所示。(2)新型荧光分子探针的配制用缓冲溶液PBS (10Mm，pH=7.4)将(I)中制得聚电解质稀释制成原溶液，同样，分别用缓冲溶液PBS( IOMm, pH=7. 4)将直链结构的单链DNAl或者发卡结构的单链DNA2溶解，最后，再取适当的聚电解质溶液与DNAl或者DNA2溶液混合，通过静电作用行成新型的直链或者发卡结构的荧光分子探针。(3) DNA杂交样品的配制用缓冲溶液PBS (10Mm，pH=7. 4)稀释不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt。其中DNA3与DNAl完全互补配对，与DNAa，DNAc7DNAt完全不互补；DNA1与DNA2部分互补配对，与DNAa, DNAc, DNAt完全不互补。分别取一定量溶解好的DNA3，DNAa, DNAc, DNAt加入(2)中配好的荧光探针样品溶液中，最后将配好的所有溶液经过5min的90°C的热处理，再在40°C下保温半小时。所述的步骤(I)所合成的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯聚电解质结构为权利要求1.一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，所述的方法步骤包括 (1)共聚物的质子化 将聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有机溶剂四氢呋喃中，在常温下反应24小时；反应结束后，将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将荧光聚电解质P (DMAEMA+-C0-Py)在真空干燥箱中以70°C温度干燥12小时； (2)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用聚丙烯酸芘甲酯？聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，所述的方法步骤包括：（1）共聚物的质子化：将聚丙烯酸芘甲酯？聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有机溶剂四氢呋喃中，在常温下反应24小时；反应结束后，将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将荧光聚电解质P(DMAEMA+？co？Py)在真空干燥箱中以70℃温度干燥12小时；（2）新型荧光分子探针的配制：用缓冲溶液PBS：10Mm，pH=7.4，将（1）中制得聚电解质稀释制成原溶液，同样，分别用缓冲溶液PBS：10Mm,pH=7.4，将直链结构的单链DNA1或者发卡结构的单链DNA2溶解，最后，再取适当的聚电解质溶液与DNA1或者DNA2溶液混合，通过静电作用行成新型的直链或者发卡结构的荧光分子探针；（3）DNA杂交样品的配制：用缓冲溶液PBS：10Mm,pH=7.4，稀释不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt；其中DNA3与DNA1完全互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补；DNA1与DNA2部分互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补；分别取一定量溶解好的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt加入（2）中配好的荧光探针样品溶液中，最后将配好的所有溶液经过5分钟的90℃的热处理，再在40℃下保温半小时。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王国杰，杨领叶，赵敏，董杰，张瑞辰，
申请(专利权)人：北京科技大学，
类型：发明
国别省市：
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