本发明专利技术提供一种用于扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含a)DNA聚合酶；b)用于核酸扩增的第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；c)用于核酸扩增的第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；和d)一种或两种热稳定切口酶，其中，所述的切口酶能在所述的第一模板或第二模板的切口位点处进行切口。
【技术实现步骤摘要】
相立申请案交叉参考本专利技术主张优先于2007年7月14日申请并且标题为“用于核酸指数式扩增的切口和延长扩增反应(NickingandExtensionAmplificationReactionfortheExponentialAmplificationofNucleicAcids)”的美国专利申请案第11/778,018号，其是全文以引用方式而提及并纳入本文中。
本专利技术一般来说涉及短DNA或RNA序列在恒温下的快速指数式扩增。
技术介绍
随着人们对可快速检测有害物种的存在或确定目标区域遗传序列的系统的需要指数式增大，体外诊断学领域快速扩展。现有分子诊断学主要检测生物标记物并且包括小分子检测、基于免疫的分析和核酸测试。两个互补或实质上互补的核酸链之间的固有特异性使得可使用单一DNA或RNA序列进行快速特异性识别，其简单性使得核酸测试具有诱人前景。用于疾病管控的对细菌和病毒威胁剂、遗传修饰食品、和单核苷酸多态性的鉴定只是这些分子诊断工具的进展极为有利的少数领域。为满足这些不断增长的需求，人们已针对这些特异性和灵敏性需求研发并调整核酸扩增技术。历史上，最常用的扩增技术是聚合酶链反应(PCR)，所述技术因其可靠性和特异性已在许多情况下成为检测方法的黄金标准。此技术需要使各种温度循环以进行以下步骤：dsDNA变性，短寡核苷酸引物复性，以及通过热稳定聚合酶沿模板来延长引物。尽管工程中的许多新进展已成功地将这些反应的时间缩短至20-30分钟，但仍然需要极高功率才能满足这些热循环单元的需求。人们已研发出各种等温扩增技术来避免温度循环的需求。出于此需求，出现了DNA和RNA等温扩增两种技术。转录介导扩增(TMA)采用具有RNA酶活性的逆转录酶、RNA聚合酶、和在5’末端具有启动子序列的引物。逆转录酶自引物合成cDNA，降解RNA靶，并在反向引物结合后合成第二链。随后RNA聚合酶结合至dsDNA的启动子区域并转录新RNA转录物，所述转录物可用作进一步逆转录的模板。反应可在20-30分钟内产生十亿倍扩增。此系统不如其它DNA扩增技术稳定，并且因此不是现场可部署测试，因为在无菌实验室外普遍存在RNA酶。此扩增技术非常类似于自我持续序列复制(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，但其所用酶不同。单引物等温扩增(SPIA)也涉及多种聚合酶和RNA酶H。首先，逆转录酶沿RNA靶延长嵌合引物。RNA酶H降解RNA靶并且使得DNA聚合酶可合成cDNA的第二链。随后RNA酶H降解一部分嵌合引物以释放一部分cDNA并开放结合位点以供下一嵌合引物结合，并且扩增过程再次进行所述循环。线性扩增系统可在约3.5hr内扩增极低水平的RNA靶。Q-β复制酶系统是探针扩增方法。将与所选靶互补或实质上互补的探针区域插入MDV-1RNA中，所述RNA是Q-β复制酶的天然存在的模板。Q-β复制MDV-1质粒以使得合成产物是Q-β复制酶模板自身，从而导致指数式扩增，只要针对模板的复制酶过量即可。因为Q-β复制工艺如此灵敏并且不论是否存在靶都可扩增，因此需要多个洗涤步骤来清洗非特异性结合复制质粒的样品。指数式扩增耗时约30分钟；然而，包括所有洗涤步骤在内的总时间为约4小时。也已研发出多种等温DNA扩增技术。滚环扩增(RCA)是基于质粒和病毒的自然复制来研发。引物沿环形模板延长，从而导致合成单链串联重复。捕获、洗涤和连接步骤对在靶存在下优先环化模板和减少背景扩增是必需的。分枝扩增(RAM)添加级联引物以供额外几何扩增。此技术涉及非特异性尺寸链的扩增，所述链为双链或单链。解旋酶依赖性扩增(HDA)利用热稳定解旋酶(Tte-UvrD)来解开dsDNA以产生单链，所述单链随后可用于引物通过聚合酶进行的杂交和延长。热稳定HAD方法不需要非热稳定HAD所需要的辅助蛋白。所述反应可在单一温度下实施，但结合引物的初始热变性可生成更多产物。据报告，扩增长70-120个碱基对的产物的反应时间超过1小时。环介导扩增(LAMP)是灵敏特异性等温扩增方法，其采用具有链置换能力的热稳定聚合酶和四种或以上种引物。所述引物设计为沿靶在正向和反向上连续复性。外引物的延长置换已延长内引物以释放单链。各引物设计为具有发夹末端，其在置换后立即咬合成发夹以促进自身引发和进一步聚合酶延长。其它环状引物可减少扩增时间，但会使反应混合物变复杂。总之，LAMP是较难多重化(也就是说同时扩增不止一个靶序列)的扩增方法，但据报导其由于具有多个必须与靶复性的引物而具有极高特异性，从而可促进扩增过程。尽管反应是在等温条件下进行，但双链靶需要初始热变性步骤。扩增在25至50分钟内进行并且产生不同长度的梯形产物。链置换扩增(SDA)是由沃克(Walker)等人在1992年所研发。此扩增方法使用两组引物、链置换聚合酶、和限制性内切核酸酶。使用缓冲引物来置换首先延长的引物以产生供下一引物结合的单链。限制位点存于引物的5’区域。将经硫醇修饰的核苷酸纳入合成产物中以抑制合成链的裂解。此修饰在链中聚合酶可延长的引物侧产生切口位点。对于双链靶来说，此方法需要初始热变性步骤。则在低于双链靶区域解链温度的温度下进行反应。使用此方法通常在30-45分钟内扩增长60至100个碱基的产物。这些和其它扩增方法论述于(例如)以下文献中：范尼斯，J(VanNess，J)等人，PNAS2003，第100卷，第8册，第4504-4509页；陈，E.(Tan，E.)等人，分析化学(Anal.Chem.)2005，77，7984-7992；利兹德，P.(Lizard，P.)等人，自然生物技术(NatureBiotech.)，1998，6，1197-1202；纳富，T.(Notomi，T.)等人，NAR2000，28，12，e63；和科恩，N.(Kurn，N.)等人，临床化学(Clin.Chem.)2005，51：10，1973-1981。关于这些一般扩增技术的其它参考文献包括(例如)美国专利第7112423号；第5455166号；第5712124号；第5744311号；第5916779号；第5556751号；第5733733号；第5834202号；第5354668号；第5591609号；第5614389号；第5942391号；和美国专利公开案第US20030082590号；第US20030138800号；第US20040058378号；和第US20060154286号。
技术实现思路
本文提供扩增核酸靶序列的方法，所述方法依赖于切口和延长反应以在短于传统扩增反应(例如链置换扩增反应)的时间范围内扩增较短序列。本专利技术实施例包括(例如)仅使用两个用来扩增靶序列的模板、一种或两种切口酶和聚合酶的在等温条件下进行的反应。在实例性实施例中，聚合酶和切口酶具有耐热性，并且反应温度显著低于杂交靶区域的解链温度。切口酶仅在双链二倍体中的一个链上切口，从而使得不需要像在习用链置换扩增情形中那样纳入经修饰核苷酸。本专利技术方法不需要初始热变性步骤。在实例性实施例中，由于反应简单，反应极易进行，不需要特殊设备(例如温度循环器)，并且可仅在约2.5至约10分钟内自基因组DNA将20-30聚体产物扩增108至1010倍。此外，在其它实例性实施例中，所述方法能不实施单独逆转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含a)DNA聚合酶；b)用于核酸扩增的第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；c)用于核酸扩增的第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；和d)一种或两种热稳定切口酶，其中，所述的切口酶能在所述的第一模板或第二模板的切口位点处进行切口。
【技术特征摘要】
2007.07.14 US 11/778,0181.一种用于扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含a)DNA聚合酶；b)用于核酸扩增的第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；c)用于核酸扩增的第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；和d)一种或两种热稳定切口酶，其中，所述的切口酶能在所述的第一模板或第二模板的切口位点处进行切口。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于一个容器中。4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于两个容器中。5.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述聚合酶和切口酶存于第一容器中，并且所述模板存于第二容器中。6.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板经冻干。7.如权利要求1所述的试剂盒，其另外包含实施所述扩增方法的说明书。8.如权利要求1所述的试剂盒，其另外包含试管。9.如权利要求1所述的试剂盒，其另外包含侧向流动装置或试条。10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述侧向流动装置或试条另外包含捕获探针。11.如权利要求1所述的试剂盒，其另外包含选自由以下组成的群组的检测部分：荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标和聚苯乙烯珠粒。12.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述模板中的至少一者包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。13.如权利要求1所述的方法，其中每个所述第一模板和所述第二模板的所述稳定区域具有...
【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·K·梅普尔斯，里贝卡·C·霍姆伯格，安德鲁·P·米勒，雅罗德·普罗文斯，理查德·罗思，杰弗里·曼代利，
申请(专利权)人：爱奥尼安技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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