本发明专利技术涉及使用外部引物对、正向和反向DNA‑RNA‑DNA杂交引物的比例不同的内部引物对、DNA‑RNA‑DNA杂交信号探针，在等温下以非对称方式扩增靶核酸的同时，扩增探针的信号，从而准确地检测靶核酸的方法。根据本发明专利技术，相比于作为现有方法的采用相同比例引物的等温引物及探针扩增方法的对称iTPA方法等，可以有效地扩增探针的信号，可应用于检测及确认正确的病原菌、检测可带来规定表现型的DNA变更、诊断遗传疾病有关感受性、DNA表现的评估及各种基因项目，有利于分子生物学研究及疾病诊断。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸和信号探针的等温扩增方法及利用扩增的信号探针的核酸检测方法，更具体地涉及利用外部引物对、脱氧核糖核酸-核糖核酸-脱氧核糖核酸(DNA-RNA-DNA)杂交引物对及DNA-RNA-D NA杂交信号探针，同时扩增靶核酸和信号探针，并迅速地检测靶核酸的方法。进一步具体地涉及，采用不同比例的正向DNA-RNA-DNA杂交引物和反向DNA-RNA-DNA杂交引物，以非对称方式扩增核酸，与此同时，利用具有在以非对称方式扩增的DNA中因过量使用引物而以非对称方式过量扩增的DNA互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针并扩增信号，从而在等温下检测核酸的方法。
技术介绍
核酸扩增技术在检测和分析少量核酸的过程中属于非常有用的技术。针对靶核酸的核酸扩增技术的高度敏感性促进了感染性疾病及遗传性疾病的诊断和分析所需的DNA分离技术以及法医学层面的特定核酸检测技术的发展，也开发了基于这种核酸检测方法而执行非常敏感的诊断分析的方法(Belkum，Current Opinion in Pharmacology，3:497，2003)。核酸的检测基于DNA链的互补性和体外中单链核酸形成双链杂交分子的能力，借助上述能力，可从样本中检测出特定核酸(B arry et al.,Current Opinion in Biotechnology，12:21，2001)。用于核酸检测的探针由存在于核酸样本的靶序列和可杂交化的特定序列组成。上述探针可由化学物质、免疫-化学物质、荧光或放射线同位素读取。大体上，探针包括针对靶核酸互补序列的短片段核酸和可读取DNA杂交的荧光物质或生物素及双加氧酶(dioxygenase)等标记或报道分子。但是，根据如上所述的核酸检测方法，无法检出尤其是染色体D NA上的短序列，复制数低，在解决野生型基因有关变形对立DNA的有限复制数方面存在局限性。作为核酸检测方法的其他存在问题，与限制靶序列、化学物质或探针与其它分子或结构的物理相互作用的体外(in vitro)或体内(in situ)的环境条件有关。靶核酸检测方法可以分组为三类，作为使靶核酸扩增的方法的靶核酸序列扩增，使探针分子本身扩增的探针扩增，将各探针表现出的信号借助复合探针或连接探针技术增加的信号扩增。体外(in vitro)核酸扩增技术用作检测和分析少量核酸的方法。其中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是最广泛使用的核算的扩增方法，将互补性序列的各螺旋(strand)用作模板，借助引物来反复进行核酸合成，由此，完成互补性序列的各螺旋的复制本。为了执行聚合酶链式反应过程，需要预先编程的热循环装备(thermal cycling instrument)。但是，这种方法所需费用高，特异性较低，而且为了呈现结果，需要将执行步骤高度标准化。作为其他核酸扩增方法的连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)，两个相邻的寡核苷酸与靶核酸杂交，借助连接酶(ligase)而连接。由此，所形成的探针(probe)与互补的核苷酸一同借助温度周期(temperature cycling)而被扩增。连接酶链式反应具有比利用引物的核酸的引物延伸(primer exten sion)高的识别力(discriminatory power)，因此，对于基因的点突变(genotyping point mutation)，相比于聚合酶链式反应(PCR)，表现出更高的对立基因特异性(allele specificity)。连接酶链式反应具有截至目前开发的核酸扩增技术中最高的特异性，所有识别机制已得到最优化，因此，可以最方便地执行，但缺点是反应速度最慢、并需
要大量的变形探针。根据如连接酶链式反应利用连接(ligation)的方法，借助在连接酶链式反应或滚环扩增(rolling circle amplication，RCA)过程中伴随的DNA接合，利用第一个圆形化的锁式探针(padlock probe)并以滚环扩增方法进行扩增，由此，无需执行靶扩增聚合酶链式反应，也可以分析DNA分型(genotyping)(Qi et al.,Nucleic Acids Research，29:e116，2001)。链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)是通过核酸内切酶来置换螺旋(strand displacement)，使样本内的靶核酸序列及其互补性螺旋扩增的方法。该方法使用包含核酸聚合酶(nucleic aci d polymerase)、至少一个被置换的脱氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)的三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)以及包含至少一个对靶片段(target fragment)的3’末端互补的引物的杂交物。各引物在5’末端具有可由限制性核酸内切酶(restriction endonucleas e)认知的序列(Walker et al.,Nucleic Acids Res.,20:1691，1992)。作为与链置换扩增方法类似的方法，有使用RNA-DNA杂交引物或RNA引物，使引物进行引物延伸后，使用用于切断与模板DNA构成杂交化的RNA引物的RNaseH酶，切断引物和模板DNA后，借助链置换而使新的引物进行引物延伸的方法；使用5’-RNA-DNA-3’引物的单引物恒温扩增(single primer isothermal amplification，SPIA)方法(美国专利6,251,639)；使用5’-DNA-RNA-3’引物的ICAN(i sothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid)方法(美国专利申请2005/0123950)；使用RNA引物的Riboprimer方法(美国专利申请2004/0180361)；利用外部引物和内部DNA-RNA-DNA杂交引物的方法(美国专利5,824,517)等。转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification，TMA)
方法是在一定温度、一定离子强度(ionic strength)及一定pH下，仅使用一个启动-引物，扩增靶核酸的方法(Kwoh et al.,Proc.Nat.Ac a.Sci.USA，86:1173，1989)。转录介导的扩增技术方法的特征在于，实质上，使由靶核酸构成的杂交物和启动-引物(promoter-primer)相结合，上述启动-引物是与用于与靶核酸的3’末端部位或与其相邻的部位杂交的靶序列的3’末端部位互补的寡核苷酸。上述启动-引物包括位于配合序列(complexing sequence)的5’末端部位的RNA聚合酶有关启动部位序列。上述启动-引物及靶序列形成启动-引物/靶序列杂交，使DNA引物延伸。在上述转录介导的扩增技术方法的DNA引物延伸(extension)过程中，据推测，靶序列的3’末端从接近配合序列和靶序列之间启动引物被杂交化的复合体(complex)的位置开始引物延伸。启动本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶DNA的检测方法，其特征在于，上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及扩增的信号探针，上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，上述反应杂交物包括：(i)靶DNA；(ii)外部引物对，具有与上述靶DNA互补的碱基序列；(iii)DNA‑RNA‑DNA杂交引物对，具有上述靶DNA和3’末端DNA部分互补且上述靶DNA和5’末端DNA‑RNA部分非互补的碱基序列；(iv)引物对，在上述DNA‑RNA‑DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例中，过量使用其中的一种而以非对称方式扩增核酸；以及(v)DNA‑RNA‑DNA杂交信号探针，具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补的碱基序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.21 KR 10-2014-00203221.一种靶DNA的检测方法，其特征在于，上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及扩增的信号探针，上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，上述反应杂交物包括：(i)靶DNA；(ii)外部引物对，具有与上述靶DNA互补的碱基序列；(iii)DNA-RNA-DNA杂交引物对，具有上述靶DNA和3’末端DNA部分互补且上述靶DNA和5’末端DNA-RNA部分非互补的碱基序列；(iv)引物对，在上述DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例中，过量使用其中的一种而以非对称方式扩增核酸；以及(v)DNA-RNA-DNA杂交信号探针，具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补的碱基序列。2.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述外部引物对为选自由寡聚DNA、寡聚RNA以及杂交寡聚RNA/DNA组成的组中的一种。3.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA杂交引物对中，5’末端DNA-RNA部分具有与靶DNA序列非互补的碱基序列，3’末端DNA部分具有与靶DNA互补的碱基序列。4.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上
\t述DNA-RNA-DNA杂交探针具有与因上述DNA-RNA-DNA引物对中过量使用的引物而被扩增的产物互补的碱基序列。5.根据权利要求4所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述正向引物和反向引物具有1:5至1:20的比例或者具有与上述比例相反的比例。6.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：金珉煥，
申请(专利权)人：迪克斯真株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。