一种新型核酸扩增反应中的探针及应用制造技术

本发明专利技术是一种新型核酸扩增反应中的探针及应用，涉及一种用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列。另外，本发明专利技术还涉及基于上述探针的试剂盒和应用等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测
，具体而言，本专利技术涉及用于检测靶基因序列的探针以及基于其的试剂盒和应用等。
技术介绍
核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展，建立一套灵敏度高，快速简便的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。现有的核酸技术根据其特点可以分为两类：第一类是靶核酸的直接扩增；包括聚合酶链式反应(PCR)、核酸依赖的扩增(NASBA)和转录介导的扩增(TMA)等。第二类是信号放大扩增；包括支链DNA(bDNA)、侵染探针(Invader)和滚环扩增(RCA)等。近年来，荧光PCR技术得到了长足的发展，因其灵敏度高、快速简便、无污染、配套齐全等特点，荧光PCR技术在临床上应用越来越广泛。荧光PCR技术一般使用荧光染料、TAQMAN探针、分子信标等，荧光染料虽然简单便宜，但是它无法识别非特异扩增，在实际应用中受限制较大。TAQMAN探针在实际应用中较为广泛，避免了非特异扩增，结果可靠，却存在荧光本底高的缺点。分子信标由于荧光本底低，能较好的区分低拷贝基因，也得到一定应用，不过其扩增效率较低。本专利技术人在现有技术没有启示的情况下，经过长期实践，开拓性地开发出了一种新型探针及应用。该探针一方面吸取了上述探针的优点，另一方面避开了上述探针的缺点。该探针设计方便、扩增效率高、荧光本底低。本专利技术的新型探针是基于对靶核酸的直接互补，而且经过精心设计，荧光本底低，开环去结合效率高，从而基本不影响同时对靶序列的扩增，使得整个检测的效率得以提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供新的用于检测靶基因序列的探针以及基于其的试剂盒和应用等。该探针可以提高荧光PCR(尤其是实时荧光PCR)检测的效率。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上n个连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列，在所述配对序列中自5’端起，第一位碱基是C，第n位是C，并且第2位至第[n/2]-1位包含至少一个C，而且，所述部分互补序列与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合。优选地，本专利技术第一方面的探针由所述配对序列、所述部分互补序列和位于所述自由序列组成。在本文中，互补结合是本领域技术人员所熟知的，指的是一个序列或序列部分从5’端起的第m位的碱基与另一个序列或序列部分从3’端起的第m位呈现A-T或C-G的配对，则这两个序列或序列部分的这两个碱基互补结合；如果这两个序列或序列部分上任意一个对应位置的两个碱基都互补结合，则这两个序列或序列部分才互补结合。另外，在本文中，中括号(“[]”)是本领域技术人员熟知的运算符，表示对所述数字取整，例如，[6.5]＝6，[7.5]＝7。优选地，在本专利技术第一方面的探针中，自由序列不与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前p个碱基起始并向前延伸的序列互补结合，而且也不与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C的5’端前的序列互补结合。而所述部分互补序列可以与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前第1位至第p为碱基的的互补结合，也可以不互补结合，优选是后者。优选地，本专利技术第一方面的探针5’端标记有荧光基团，而且其3’端标记有淬灭基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/Green I、/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/、ROXTM/Texas和等常规产品，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。优选在本专利技术的第一方面的探针中，荧光基团可以是FAM，TAMRA，ROX或Cy5，优选是FAM。优选地，在本专利技术第一方面的探针中，n为10～20，优选为12～18，更优选为13～15。优选地，在本专利技术第一方面的探针中，p为2～5，优选为2～4，更优选为 2～3。优选地，在本专利技术第一方面的探针中，所述自由序列的碱基数为2～5，优选为2～4，更优选为2～3。在本文中，如无相反指示，靶基因和靶核酸可以是互换使用。靶基因可以存在于离体样品中，如食品、空气、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。本专利技术仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本专利技术的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。当然，由于这些病毒可以经口、鼻传播，因此本专利技术的实时PCR方法可以针对食品和/或空气样品进行检测，用于环境安全领域，不涉及疾病的诊断和治疗。优选地，在本专利技术第一方面的探针中，靶是HBV或HCV。在本专利技术的具体实施方式中，探针为CCCTTCTCGTGTTACAGGCG或CTTGCGAGTGCCCCGGGA。在第二方面，本专利技术提供了用于检测靶基因序列的试剂盒，其包括本专利技术第一方面的探针。试剂盒中不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应并且在检测靶基因序列中将混合使用的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示检测(如，实时荧光PCR检测)靶基因序列。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本专利技术的范围内。优选地，本专利技术第二方面的试剂盒还包括能扩增所述靶基因序列或其部分的引物对，其中所述部分包括所述n个连续碱基。在本专利技术的具体实施方式中，引物对为GGACCCTGCGCTGAACATG和 GCGGTATTGTGAGGATTCTTG，或为TTGCGAACGGCCTTGTGGTA和HCV-R:GTAAACTCCGCCAACGATCTG。本专利技术第二方面的试剂盒还包括用于荧光PCR的试剂和/或仪器。优选地，本专利技术第二方面的试剂盒还可以包括DNA聚合酶、dNTP、反转录酶和/或缓冲液。在第三方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的探针在制备本专利技术第二方面的试剂盒中的应用。在第四方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的探针在检测靶基因序列中的应用。在第五方面，本专利技术提供了本专利技术第二方面的试剂盒在检测靶基因序列中的应用。优选地，第四方面或第五方面的应用是非诊断应用。在第六方面，本专利技术提供了一种制备探针的方法，其包括：(1)搜索靶序列，挑出n个连续碱基的部分，所述部分中自5’端起，第一位碱基是G，第n位是G，并且第n-[n/2]+1位至第n-1位包含至少一个G，以与所述部分互补结合的序列作为配对序列；(2)以与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合的序列作为部分互补序列；(3)构建自由序列，所述自由序列不与所述靶序列上所述n个连续碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上n个连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列，在所述配对序列中自5’端起，第一位碱基是C，第n位是C，并且第2位至第[n/2]‑1位包含至少一个C，而且，所述部分互补序列与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]‑1位中C起始的p个连续碱基互补结合。

【技术特征摘要】
1.用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上n个连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列，在所述配对序列中自5’端起，第一位碱基是C，第n位是C，并且第2位至第[n/2]-1位包含至少一个C，而且，所述部分互补序列与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合。2.权利要求1所述的探针，其5’端标记有荧光基团，而且其3’端标记有淬灭基团。3.权利要求1所述的探针，其中，n为10～20，优选为12～18，更优选为13～15；p为2～5，优选为2～4，更优选为2～3；和/或，所述自由序列的碱基数为2～5，优选为2～4，更优选为2～3。4.权利要求1所述的探针，其中，靶是HBV或HCV。5.权利要求1所述的探针，其为CCCTTCTCGTGTTACAGGCG或P:CTTGCGAGTGCCCCGGGA。6.用于检测靶基因序列的试剂盒，其包括权利要求1～5之任一所述的探针。7.权利要求6所述的试剂盒，其还包括能扩增所述靶基因序列或其部分的引物对，如GGACCCTGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志武，李振勇，付昕，丁春花，顾晓雅，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32