人EGFR基因突变检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人EGFR基因的多突变的检测方法，其包括在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针；进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。另外，本发明专利技术还涉及可以用于该检测试剂盒的核酸组合等。

【技术实现步骤摘要】
人EGFR基因突变检测试剂盒及其应用
本专利技术属于核酸检测
，具体而言，本专利技术涉及一种人EGFR基因的多突变的检测试剂盒及检测方法。另外，本专利技术还涉及可以用于该检测试剂盒的核酸组合等。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR)的突变与一些疾病(如，非小细胞肺癌)或其疗效存在弱关联，尽管无法用于直接判定相应疾病或其疗效，但是可以作为整个诊断的一小部分，将相应结果与其他检测结果综合判读，从而最终得出诊断结果。EGFR的突变十分多，主要集中于其基因的第18、19、20和21号外显子，尤以19号外显子和21号外显子突变为主，新的突变也在不断被发现之中(如参见中国专利200680013839和201010100949等)，其中许多与疾病的关联性仍在研究之中。尽管采用基因测序技术来检测这些突变是最直接的，但是出于成本考虑，目前也有一些基于PCR的检测技术来检测EGFR的突变，例如，中国专利200410103223号公开了检测表皮生长因子受体基因点突变方法，中国专利200610027918号公开了EGFR基因突变的快速检测，中国专利200610035604号公开了检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒，中国专利200810027672号公开了引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒，201010131040号公开了人表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒，中国专利201010148299号公开了一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物及其设计方法，中国专利201010504423号公开了检测EGFR基因突变的试剂及其应用，中国专利201110020982号公开了表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒及方法，中国专利201110054629号公开了检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法，中国专利2011100705149号公开了用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法，中国专利201210291816号公开了检测EGFR基因突变位点的试剂盒，中国专利201210334208号公开了检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法，中国专利201310092075号公开了检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、方法及试剂盒。然而，本专利技术人发现，上述基于PCR的检测技术要么检测的EGFR突变的种类不够多，要么检测的准确性不高，尤其是检测突变的引物也容易把野生型EGFR也扩增并检测出来，造成假阳性结果。由于在实际的检测工作中野生型EGFR的样品比例占绝大多数，如果无法避免假阳性结果出现，则该检测技术几乎无实际应用的前景。本专利技术人长期致力于单管多重PCR检测的研究工作，但是为了检测足够多的EGFR突变，最终跳出了单管多重PCR检测的框架(当然同一管中仍然有超过40个引物和探针)，采用不对称多重分组技术，在同一PCR轮次中判定大量EGFR突变的存在性，在灵敏检测的基础上保证了准确性(特异性)，尤其是避免了假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的人EGFR基因突变的检测方法，其能在尽量多重检测的基础上，特异性好，灵敏度高，结果判读方便。另外，本专利技术还提供可用于上述方法的检测试剂盒和核酸混合物等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了一种人EGFR基因突变的检测方法，其包括：(1)在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针，其中，每个反应管中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：管编号引物探针1SEQIDNOs:1-39SEQIDNO:702SEQIDNOs:40-42SEQIDNO:713SEQIDNOs:43-45SEQIDNO:724SEQIDNOs:46-52SEQIDNO:735SEQIDNOs:53-59SEQIDNO:746SEQIDNOs:60-62SEQIDNO:757SEQIDNOs:63-65SEQIDNO:768SEQIDNOs:66-67SEQIDNO:77，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团；(2)进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。在这8个PCR管之外，还可以包括其他PCR管，例如作为阴性对照管，其中用水取代核酸提取液；又如阳性对照管，其中用已知存在突变或野生型EGFR的样品取代核酸提取液。在本文中，术语“编号”用以区分同类别的多个物体(即用以表示被赋予不同编号的物体之间是不相同的)并可用于指代和引用，而并非确定性的具体编号。具体编号可以以一一对应的方式用其他编号方式而被重新映射。可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利200610030229.5、200710118802.2和201110105181.0等。优选采用本专利技术人进一步优化的磁珠提取法，其对于提取人EGFR中的核酸，更为可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。因此，优选在本专利技术的第一方面的方法中，核酸提取液是从样品中提取的，例如，其中提取是采用磁珠提取法提取的。即优选本专利技术的第一方面的方法包括提取样品中的核酸以获得核酸提取液的步骤。在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、尿液、唾液、医疗用品或药品等。本专利技术的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的血液样品检测(如，对群体血液样品检测，其群体百分比数据结果可供公共卫生机构人力和药物准备之用，也可供医疗保险机构预算之用，而非对患者进行诊断)。本专利技术的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本专利技术的检测方法检测人的血液样品中的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人EGFR基因突变的检测方法(优选是非诊断方法)，其包括：(1)在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针，其中，每个反应管中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：管编号引物探针1SEQ ID NOs:1‑39SEQ ID NO:702SEQ ID NOs:40‑42SEQ ID NO:713SEQ ID NOs:43‑45SEQ ID NO:724SEQ ID NOs:46‑52SEQ ID NO:735SEQ ID NOs:53‑59SEQ ID NO:746SEQ ID NOs:60‑62SEQ ID NO:757SEQ ID NOs:63‑65SEQ ID NO:768SEQ ID NOs:66‑67SEQ ID NO:77，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQ ID NOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团；(2)进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。...

【技术特征摘要】
1.用于检测人EGFR基因突变的试剂盒，其包括8个容器，其中，每个容器中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：容器编号引物探针1SEQIDNOs:1-39SEQIDNO:702SEQIDNOs:40-42SEQIDNO:713SEQIDNOs:43-45SEQIDNO:724SEQIDNOs:46-52SEQIDNO:735SEQIDNOs:53-59SEQIDNO:746SEQIDNOs:60-62SEQIDNO:757SEQIDNOs:63-65SEQIDNO:768SEQIDNOs:66-67SEQIDNO:77，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团，而且其中每个容器还进一步包含内对照核酸、内对照引物和内对照探针，其中内对照核酸的核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示，内对照引物的核苷酸序列如SEQIDNOs:68-69所示，内对照探针的核苷酸序列如SEQIDNO:78所示，而且所述内对照探针标记有荧光基团和淬灭基团。2.权利要求1所述的试剂盒，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是相同的；核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团与所述内对照探针的荧光基团是不同的。3.权利要求1所述的试剂盒，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是FAM；所述内对照探针的荧光基团是VIC。4.权利要求1所述的试剂盒，其还进一步包括DNA聚合酶和dNTP。5.权利要求1所述的试剂盒，其还进一步包括磁珠提取法所需试剂，优选其中磁珠提取法所需试剂包括：核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液；第一次洗涤所用的洗涤液，其包含高氯酸钠和乙醇；第二次洗涤所用的洗涤液，其包含乙醇；和，洗脱所用的洗脱液，其包含pH缓冲液。6.权利要求5所述的试剂盒，其中pH缓冲液是Tris-HCl。7.权利要求1所述的试剂盒，其还包括进一步对核酸提取液检测的试剂容器。8.权利要求7所述的试剂盒，其中进一步对核酸提取液检测的试剂容器是进行实时PCR检测的试剂容器。9.权利要求8所述的试剂盒，其中进行实时PCR检测的试剂容器包括分别包含如下表所示的引物和探针的容器：10.权利要求1～9之任一所述的试剂盒在制备用于人EGFR基因突变的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志武，李振勇，付昕，李秀冬，曹喜佳，顾晓雅，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32