用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物和用途技术

本发明专利技术提供了用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物。本发明专利技术还提供了具有所述变体识别位点的核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。本发明专利技术提供了鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的具有提高的底物活性的变体识别位点的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物和用途本申请要求提交于2013年3月12日的美国专利申请序列号61/777238的权益，其全文以引用方式并入本文中。
本专利技术涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及鉴定和使用罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法。
技术介绍
重组DNA技术已经使其能够将外来DNA序列插入生物体的基因组中，因此改变生物体的表型。最常使用的植物转化方法是农杆菌(Agrobacterium)感染和基因枪轰击，其中转基因以随机方式并以不可预测的拷贝数整合到植物基因组中。因此，已经对控制植物中的转基因整合作出了努力。已经开发了用于将DNA序列插入多种生物体的基因组中或修饰DNA序列的方法，并且可涉及位点特异性整合技术，所述技术依赖于同源重组(2006年9月5日授予的美国专利7,102,055)或者设计子内切核酸酶，诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALEN(2009年5月21日公布的美国专利公布2009-0133152A1)。虽然这些体系已经提供了用于靶向插入受关注的序列的有用技术，但仍然需要鉴定罕见切割双链断裂诱导剂的更多识别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法，所述双链断裂诱导剂能够在预期识别位点中引入罕见双链断裂，所述方法包括：a.使基因组DNA与能够向所述基因组DNA中引入双链断裂的罕见切割工程化双链断裂诱导剂接触，其中所述双链断裂产生核苷酸悬端；b.将第一接头连接到所述核苷酸悬端；c.剪切步骤(b)中获得的连接DNA并将至少一个第二接头连接到经剪切的核苷酸末端以允许所述双链断裂周围的基因组DNA片段扩增和测序；d.将(c)中获得的DNA片段的核苷酸序列与参考基因组DNA序列进行比对；以及e.鉴定在与所述工程化双链断裂诱导剂的预期识别位点比较时包含至少一个核苷酸碱基改变的变体识别位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.12 US 61/7772381.一种用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的体外方法，所述双链断裂诱导剂能够在预期识别位点中引入罕见双链断裂，所述方法包括：a.使分离的基因组DNA与能够向所述基因组DNA中引入双链断裂的罕见切割工程化双链断裂诱导剂接触，其中所述双链断裂产生核苷酸悬端，或其中将一个或多个核苷酸添加至所述双链断裂以生成核苷酸悬端；b.将第一接头连接到所述核苷酸悬端，其中所述接头包含至少一个核苷酸的悬端，所述悬端与步骤a中的双链断裂的核苷酸悬端互补；c.剪切步骤（b）中获得的连接的DNA并将至少一个第二接头连接到经剪切的核苷酸末端以允许所述双链断裂周围的基因组DNA片段的扩增和测序；d.将（c）中获得的DNA片段的核苷酸序列与参考基因组DNA序列进行比对；以及e.鉴定在与所述工程化双链断裂诱导剂的预期识别位点比较时包含至少一个核苷酸碱基改变的变体识别位点；其中所述双链断裂诱导剂选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、TAL效应物核酸酶、转座酶、Cas内切核酸酶和位点特异性重组酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸悬端为3’核苷酸悬端。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸悬端为5’核苷酸悬端。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因组DNA选自原核DNA、真核DNA和合成DNA。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述真核DNA是从植物、酵母或动物中分离的。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述植物选自大豆、向日葵、苜蓿、卡诺拉、棉花、烟草、马铃薯、拟南芥、红花、玉米、稻、高粱、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草和柳枝稷。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链断裂诱导剂衍生自I-CreI。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：S德斯钱普斯，J恩格里斯，Z李，V拉卡，JK杨，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US