双链断裂诱饵及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于干扰双链断裂（ＤＳＢｓ）的ＤＮＡ修复的组合物和方法。本发明专利技术公开了新的双链核酸分子，其用作诱饵并劫持负责ＤＮＡＤＳＢ感应、信号传导和／或修复途径，特别是ＤＳＢ修复的非同源性末端连接（ＮＨＥＪ）途径的酶的全复合物。本发明专利技术公开了这些分子作为佐剂组合物，与可药用载体组合，与ＤＮＡ断裂性治疗特别是放射疗法或化学疗法结合使用，以有效量导入到肿瘤细胞的核中，以便暂时中和它们的ＤＮＡ修复能力并触发它们的死亡的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双链断裂诱馆及其应用本专利技术涉及了在哺乳动物细胞中干扰DNA修复途径的组合物和 方法。具体来说，本专利技术涉及了干扰DNA损伤的感应、信号传导和/ 或修复途径、特别是双链断裂(DSB)修复的非同源性末端连接(NHEJ) 途径的核酸分子，以及它们的应用，特别是用于触发经历了抗癌症疗 法的肿瘤的细胞致死。本专利技术公开一类新型核酸分子，被称为DSB 诱饵或Dbait (双链断裂诱饵)，可用于哺乳动物对象中的各种 不同的治疗性病症，用于干扰DNADSB修复途径。
技术介绍
放射疗法和化学疗法、单独地或与外科手术相结合，是针对人类 癌症的主要治疗手段。离子化辐射直接或间接地引起双链断裂(DSBs)并触发细胞/组织 死亡(坏死或凋亡)。离子化辐射的细胞毒性效应形成了广泛用于人 类癌症治疗的放射疗法的基础。目前，放射疗法的效率受到了某些肿 瘤(例如，成胶质细胞瘤、头颈鳞状上皮细胞腺癌)的放射性抗性以 及辐射邻近正常组织引起的副作用(例如在乳腺癌和宫颈癌的治疗中) 的限制。在过去的几年，许多研究集中于与离子化辐射反应有关的生物学 机制，以便获得对潜伏在肿瘤细胞的放射性敏感性或放射性抗性之下 的现象的复杂性的了解。对精细调控对离子化辐射的反应的不同途径 的理解，是朝向鉴定新的药物和疗法的分子靶的一个重要步骤，这些 新的药物和疗法与放射疗法相结合，可以增加从对辐射具有高度抗性 的肿瘤，例如脑部或头颈肿瘤复原的机会。化疗药剂的使用可能引起DNA损伤，包括直接或间接的DSBs。使用最多的化疗药剂(化学细胞毒性药剂)家族的例子是拓扑异构酶I或II抑制剂(喜树碱/拓扑替康，表柔比星/依托泊苷)，DNA交 联剂(顺铂/卡铂/奥沙利铂)，DNA烷基化试剂(卡莫司汀/达卡巴嗪) 或抗代谢药剂(5-氟尿嘧啶/吉西他滨/卡培他滨)，以及有丝分裂纺锤 体抑制剂(紫杉醇/多烯紫杉醇/长春瑞滨)。开发生物药物(单克隆抗体、细胞因子/激酶抑制剂、免疫治疗剂 /疫苗)中的最新进展已经证明了它们对一部分肿瘤的效力和特异性。 但是它们通常与化学细胞毒性药剂结合使用。尽管在开发新的细胞毒 性药物中有许多进展，但是对化学疗法的药物抗性仍然是癌症治疗中 的主要临床关注的问题。对于涉及药物摄入/流出、代谢降解、耙的诱 变、增强的修复、细胞死亡(凋亡和坏死)的信号传导的药物抗性的 机制的理解，对于特别是在某些对治疗有抗性的肿瘤中保证化疗的效 力和改善治疗指标是非常必要的。化学疗法和放射疗法的结合被广泛用于癌症治疗中。尽管还没有 完全阐明，但细胞毒性药剂的作用的生物学基础依赖于细胞机制，例 如细胞周期或DNA损伤，它们对于放射性诱导的细胞死亡也是重要的， 因此当在癌症治疗中组合不同的治疗方法时导致了加成的或甚至更好 的协同效益。在最近10年中，在该领域进行了许多研究，对辐射作出反应的信 号传导的复杂性进行描述。在这一方面，特别感兴趣的作为离子化辐 射的耙的基因是参与辐射诱导的致死机制的调控，例如凋亡或DNA修 复的基因。因为DSBs是最致命的DNA损伤，当DSB修复增加时，离 子化辐射的效力降低了。两种机制参与了 DSBs的修复非同源性末端连接(NHEJ，不依 赖于序列的途径)和同源重组(HR，序列依赖性途径)(综述在Jackson,2002中)。对参与这两种主要DSB修复途径的基因进行的定向到目前 为止导致了很少或中度的放射性敏感性，这依赖于所使用的方法和癌 症细胞系(Belenkov等，2002; Mamngoni等，2000; Ohnishi等，1998)。Ku (例如Ku70和Ku80)和DNA-PKcs蛋白在放射性或化学物质 诱导的DNA DSBs的修复中是重要的。如果损伤没有被及时修复，细 胞将死亡。因此，它们代表了用于使靶细胞和组织对放射疗法和化学 疗法致敏的潜在有兴趣的分子靶。据此，已经设想了许多方法并进行 了尝试，以抑制这些参与在哺乳动物细胞中占优势的NHEJ途径的关键 蛋白 (Ku70/Ku80， DNA隱PKcs等)1) PI3K抑制剂(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKcs、 ATM、 ATR) (Boulton等，2000; D腦nt & Ka腿，2003; Willmore等，2004; Vauger等2004);2) 显性失活的肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000; Kim 等，2002);3) 单链抗体可变区片段(scFv) (DNA-PKcs) (Li等，2003);4) RN A适体(Aptamer) (SELEX: RNA结合的Ku) (Yoo&Dynan: 1998);5) 反义物(Ku70， Ku80， DNA-PKcs) (Li等，2003b; Marangoni 等，2000; Sak等，2002);6) siRNA (DNA陽PKcs) (Peng等，2000)。尽管作出了这些极大的努力，将参与DNA修复途径的基因的靶向 与癌症疗法相结合仍然处于早期实验阶段，到目前为止，还没有临床 研究显示出任何被证明的益处。值得注意的是上面描述的方法具有共 同的特点它们靶向于参与具有可能的旁路或补偿途径的复杂的级联 途径(例如NHEJ)的单个效应子(蛋白)。专利技术简述本专利技术涉及在哺乳动物细胞中干扰DNA修复途径的新的组合物和方法。具体来说，本专利技术涉及以非基因特异性方式干扰DNA损伤的 感应、信号传导和/或修复途径的核酸分子，以及它们的应用，特别是 用于触发经历了抗癌症疗法的肿瘤的细胞致死。本专利技术人已经发现，细胞对直接或间接DNA损伤疗法的敏感性可 以通过使用(化学修饰的或未修饰的)短dsDNA分子来加强，这些短 dsDNA分子用作断裂DNA片段的模拟物，并被识别成DNA损伤治疗 所诱导的DSB位点(即DSB的底物模拟物)。正如在实施例中显示的，本专利技术的分子在体外和体内都有效，可 用于赋予或增加任何肿瘤细胞对DNA损伤性癌症疗法的敏感性。因此，本专利技术的一个目标涉及这样的dsDNA分子，也被命名为 DSB诱饵分子(縮写为Dbait (双链断裂诱饵))，它们能够增加 对治疗有抗性的肿瘤对放射疗法和化学疗法的反应。正如将在下面进 一步公开的那样，Dbait子通过引诱和劫持DNA修复酶的全复合物 (holocomplex)起作用，从而干扰DNA损伤的感应、信号传导和/或 修复过程。这种新的方法被命名为DNA诱饵。在优选实施方案中，本专利技术涉及Dbait分子，它是核酸分子，其中 该分子含有至少24bp的双链部分，具有至少一个游离末端，无CpG， 与人类基因组中的任何基因具有小于70%的序列同一性，在每条链的 末端或至少在3'末端链上含有一个或几个硫代磷酸酯或具有甲基膦酸 酯骨架的核苷酸，其中所述分子是参与双链断裂(DSB)修复的NHEJ 途径的至少Ku蛋白的结合底物。优选情况下，Dbait分子选自 Dbait32Ha、 Dbait32Hb、 Dbait32Hc、 Dbait32Hd、 Dbait32Hc-3，mp 、 Dbait32Hc國5，3，mp、Dbait32Hc-Cy3、Dbait32Hc-Cy5禾n Dbait32Hd-FITC。 更优选情况下，Dbait分子是Dbait32本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸分子，其中所述分子含有至少２４ｂｐ的双链部分，具有至少一个游离末端，无ＣｐＧ，与人类基因组中的任意基因具有小于７０％的序列同一性，在每条链的末端或至少在３′末端链含有一个或几个硫代磷酸酯或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸，并且其中所述分子是至少被参与双链断裂ＤＳＢ修复的ＮＨＥＪ途径的Ｋｕ蛋白结合的底物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-9-21 11/524,5281.核酸分子，其中所述分子含有至少24bp的双链部分，具有至少一个游离末端，无CpG，与人类基因组中的任意基因具有小于70％的序列同一性，在每条链的末端或至少在3′末端链含有一个或几个硫代磷酸酯或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸，并且其中所述分子是至少被参与双链断裂DSB修复的NHEJ途径的Ku蛋白结合的底物。2. 权利要求1的分子，其中所述分子包含24到100个bp。3. 权利要求1或2的分子，其中所述分子是线性的或发夹状的核 酸分子。4. 权利要求3的分子，其中所述分子是发夹状的核酸分子，并且 其中的环含有核酸或化学基团。5. 权利要求1到4任一项的分子 或3'-突出的。6. 权利要求1到5任一项的分子 增强的非正常外源DNA整合。7. 权利要求1到6任一项的分子 有Ku70或Ku80的Ku复合物结合。8. 权利要求1到7任一项的分子 有DNA-PKc蛋白的Ku复合物结合。9. 权利要求1到8任一项的分子 到细胞核中。，其中游离末端是平的或者是5'-，其中所述分子在体外抑制辐射其中所述分子在体外与至少含其中所述分子在体外与至少含，其中所述分子能够被细胞摄入10. 权利要求1到9任一项的分子，其中所述分子含有2'-脱氧核 苷酸骨架，并任选地含有一个或几个修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞 嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶之外的核碱基。11. 权利要求io的分子，还含有糖模拟物，诸如代替呋喃戊糖基 团的2'-0-垸基核糖、2'-0-烷基-C4'支链核糖、环丁基或其它碳环或己 糖醇。12. 权利要求1到11任一项的分子，还含有至少一种内嵌的元件， 其妨碍DNA复制、DNA修复或损伤性信号传导过程，所述至少一个 元件被掺入到双链分子的中心或末端。13. 权利要求12的分子，含有a) 聚乙二醇链、优选为六甘醇链，或任意烃链，任选被一个或 多个杂原子例如氧、硫、氮，或含有一个或几个杂原子的杂芳基或...

【专利技术属性】
技术研发人员：马里迪特雷，孙建生，
申请(专利权)人：法国居里学院，法国国家科学研究中心，国家自然博物馆，法国国家卫生及研究医学协会，
类型：发明
国别省市：FR[法国]