用于引发肿瘤细胞致死的核酸制造技术

本发明专利技术涉及双链核酸片段，包括一个化学修饰的主链，至少４－１０００ｂｐ，优选８－５００ｂｐ，最优选１６－２００ｂｐ。公开的分子（ＤＲＩＬ分子）可干扰ＤＮＡ损伤信号传导和修复途径，特别是双链断裂修复的非同源性ＮＨＥＪ途径。本发明专利技术公开了ＤＲＩＬ分子作为佐剂成分与ＤＮＡ阻断治疗，特别是放疗或化疗结合，连同药物载体，以有效量导入肿瘤细胞核，以引发肿瘤细胞／组织的ＤＮＡ修复诱导的致死（简称ＤＩＲＬ）的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于寡核苷酸/DNA片段在生物学和治疗学应用中的用途领域，更具体的是属于核酸干扰DNA损伤信号传导和修复途径，特别是双链断裂(DSB)修复的非同源性末端连接(NHEJ)途径的领域。本专利技术涉及用作引发接受抗癌治疗的肿瘤的细胞致死的工具的核酸。单独的放疗、化疗，或者结合手术是对抗人类癌症的主要治疗手段。电离辐射直接或间接地引起双链DNA断裂(DSBs)，并引发细胞/组织死亡(坏死或凋亡)。电离辐射的细胞毒性效应形成了广泛应用于人类癌症治疗的放疗的基础。某些肿瘤(例如，恶性胶质瘤)的辐射抗性和辐射对附近正常组织的副作用(例如，在乳腺癌和子宫颈癌的治疗中)目前限制了放疗的功效。在过去几年中，很多研究集中与电离辐射应答有关的生物学机制，是为了洞察肿瘤细胞的放射敏感性或放射抗性现象之下的复杂性。对于精细调节对电离辐射的应答的不同途径的理解是迈向鉴定新的药物和疗法的分子靶的重要一步，所述新的药物和疗法与放疗结合，可以提高从对辐射具有高度抗性的肿瘤例如脑或头和颈部肿瘤痊愈的机会。化疗药剂的使用可引起DNA损伤，包括直接或间接的DSBs。最广泛使用的化疗药剂(化学细胞毒素)家族的实例为拓扑异构酶I或II的抑制剂(喜树碱/拓扑替康，表柔比星/依托泊苷)(camptothecin/topotecan，epirubicin/etoposide)，DNA交联剂(顺铂/卡铂/奥沙利铂)(cisplatin/carboplatin/oxaliplatin)，DNA烷基化试剂(卡莫司汀/卡达巴嗪)(carmustine/dacarbazine)或抗新陈代谢的试剂(5-氟尿嘧啶/吉西它滨/卡培它滨)(5-fluorouracil/gemcitabine/capecitabine)，以及有丝分裂纺锤体的抑制剂(紫杉醇/多西它赛/长春瑞滨)(paclitaxel/docetaxel/vinorelbine)。生物细胞毒素(单克隆抗体，细胞因子/激酶抑制剂，免疫治疗剂/疫苗)开发的新近进展证明了它们对一部分肿瘤具有有效性和特异性。但是它们经常与化学细胞毒素结合使用。尽管在新的细胞毒素药物开发上有很多进展，对化疗的耐药性仍然是在癌症治疗中主要的临床忧虑。对涉及药物吸收/流出、代谢降解、靶的突变、增强的修复、细胞死亡(细胞凋亡和坏死)的信号传导的耐药机制的理解对于保证化疗的功效是非常重要的并提高了治疗指数，尤其是抗性肿瘤的治疗。化疗与放疗相结合被广泛应用于癌症的治疗。虽然仍未完全阐明，细胞毒素作用的生物学基础依赖于细胞机制，例如细胞周期或者DNA损伤，它们在射线诱导的细胞死亡中也是重要的因素，在癌症治疗中，通过组合不同的治疗方法，引起加和的或者甚至更好的协同效益。在过去十年中，在本领域展开了许多研究。有人开始对辐射应答的信号转导的复杂性进行描述。电离辐射靶向的特别重要的基因是那些参与调节辐射诱导的致死机制，如细胞凋亡或DNA修复的基因。电离辐射诱导的细胞死亡主要依赖于DSBs的修复。有两个机制参与这些损害的修复非同源性末端连接(NHEJ，不依赖序列的途径)和同源重组(HR，依赖序列的途径)(Jackson的综述，2002)。靶向参与这两种主要的DSB修复途径的基因导致少许或者中等的辐射敏感度，这依赖于使用的方法和癌症细胞系(Belenkov等，2002；Marangoni等，2000；Ohnishi等，1998)。Ku70和Ku80，DNA-PKsc蛋白在辐射或化学诱导的DNA损伤的修复中起重要作用。如果损伤不能被及时修复，则细胞死亡。因此，它们是使靶细胞和组织对放疗和化疗敏感的令人感兴趣的分子靶。已经设想并实施了很多方法用于抑制这些参与NHEJ途径的关键蛋白(Ku70/Ku80，DNA-PKsc等)，而NHEJ途径被认为在哺乳动物细胞中占主导地位的1)PI3K的抑制剂(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKsc，PARP-1，ATM，ATR)(Boulton等，2000；Durant & Karran，2003；Willmore等，2004；Vauger等，2004)2)负显性(Negative dominant)和肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000；Kim等，2002)3)单链抗体可变片段(scFv)(DNA-PKsc)(Li等，2003)4)RNA适体(SELEXRNA结合Ku)(Yoo & Dynan，1998)5)反义(Antisense)(Ku70，Ku80，DNA-PKsc)(Li等，2003b；Marangoni等，2000；Sak等，2002)6)siRNA(DNA-PKsc)(Peng等，2000).尽管付出了这些极大的努力，DNA修复基因靶向与癌症治疗的结合迄今为止仍处于早期实验阶段，尚未有临床研究显示任何被证实效益。值得注意的是，以上描述的方法具有共同的特征它们靶向参与可能具有旁路的复杂级联途径(例如NHEJ)的单一的效应器(蛋白)。本专利技术的专利技术人发现，通过使用化学修饰的或者非双链的核酸分子，充当断裂的DNA片段的模拟物并被识别为DNA损伤治疗诱导的DSB位点，可以提高肿瘤针对直接的或间接的DNA损伤抗癌治疗的敏感度。经上述修饰的分子应该有非复制结构。因而本专利技术的一个目的是为了提供这样的双链核酸片段，下面也称“DNA修复诱导的致死”(简称DRIL)分子，可以增强治疗抗性的肿瘤对放疗和化疗的应答。更具体的是，本专利技术旨在提供与能引起DNA的直接或者间接DSBs的物理和化学药剂组合应用的新的DRIL分子，并提供一种治疗癌症的方法，将上述DRIL分子的应用与直接或间接引起DNA损伤的抗癌疗法结合使用。本专利技术的另一个目的涉及DRIL分子在制备用于提高癌症疗效，尤其是用于对放疗和/或化疗具有高度抗性的肿瘤的抗肿瘤治疗佐剂中的应用。本专利技术的DRIL分子是参与NHEJ途径(不依赖序列的途径)的蛋白，尤其是Ku蛋白的底物，包括一个至少4-10000个碱基对(bp)，尤其是4-1000bp的不依赖序列的主链。它们具有如下的特性-当与药物载体一起使用时，双链DRIL分子可以被细胞/组织体吸收到细胞核中；-DRIL分子的游离末端可被参与双链断裂修复和损伤信号传导的DNA结合蛋白所识别；-DRIL分子的游离末端可被上述的酶整合到肿瘤细胞的基因组DNA中。根据DRIL分子通过NHEJ途径起作用的机制，除应用上的考虑以外，它们的长度本身没有限制，但必须包括至少4bp，更优选至少8bp。因而，本专利技术的DRIL分子优选8-500bp，最优选16-200bp。特别优选的DRIL分子包括16-100bp，更优选24-100bp。本专利技术的DRIL分子，有一个天然的磷酸二酯主链，或者一个化学修饰的磷酸二酯主链，或者带有化学基团或化学基团混合物的另一主链，只要所述修饰的寡聚物保持了作为参与NHEJ途径的蛋白，尤其是Ku蛋白，和涉及DSB损伤信号传导途径的蛋白的底物。优选地，化学修饰的目的在于，在如果发生了基因组整合后，给DRIL分子赋予稳定性和/或阻止它们的进一步的复制(诱变效应的可能原因)。也可以用糖模拟物如′-O-烷基核糖、2′-O-烷基-C4′支链核糖、环己基或者其他的碳环或本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ修复诱导的致死分子（ＤＲＩＬ分子），包括一个至少４－１００００个碱基对（ｂｐ），尤其是４－１０００ｂｐ的依赖序列的主链，其是参与ＮＨＥＪ途径（不依赖序列的途径）的蛋白，尤其是Ｋｕ蛋白，和ＤＳＢ损伤信号传导途径的蛋白的底物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马里迪特雷，孙建生，
申请(专利权)人：法国居里学院，法国国家科学研究中心，国家自然博物馆，法国国家卫生及研究医学协会，
类型：发明
国别省市：FR[法国]