结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有三类：选自CEA、Survivin、MAP2K6、PTPN11中的至少两种的结直肠癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、CDH1、KRT17、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI1、CTNNB1、FN1、TWIST1至少一种的间质细胞标志基因mRNA。本发明专利技术在各种类型癌症通用CTCs上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的基础上增加了结直肠癌细胞标志基因的检测，避免了血液中非肿瘤上皮细胞及采样过程引入正常上皮细胞等因素造成的假阳性结果，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为结直肠癌循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。
技术介绍
结直肠癌(colorectalcancer)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，是世界第三高发恶性肿瘤，死亡率位居恶性肿瘤第四位。其早期症状不明显，可通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径播散到其他组织和脏器。结直肠癌治疗的关键在于早发现、及时诊断和手术根治。预后主要取决于早期诊断和及时手术治疗，一般癌肿只限于肠壁者预后较好，浸润到肠外者预后较差，年轻患者、癌瘤浸润广泛、有转移者或有并发症者预后不良。尽管联合应用手术、化疗、放疗可提高患者的生存率，但仍有大量患者因术后转移和复发死亡。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)是因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，进入外周血中的各类肿瘤细胞的统称，目前认为CTCs可能是肿瘤转移的早期阶段。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强。根据CTCs抗原标志物的差异，目前CTCs主要可分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)和上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)等，不同类型CTCs具有不同的迁移和侵袭能力。因此，对结直肠癌患者循环肿瘤细胞进行鉴定和分型对其早期诊断、治疗指导以及预后等具有重要意义。虽然CTCs检测在结直肠癌中得到较广泛的应用，通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch检测系统也可用于结直肠癌患者外周血中CTCs的检测和计数，但是CellSearch检测系统是以上皮细胞标志物为靶点对CTCs进行计数，因此无法检测到丢失上皮抗原的CTCs，导致检出的CTCs数目低于患者外周血中实际数目。与其他癌症类型一样，目前结直肠癌患者CTCs的鉴定和分型主要依赖于通用CTCs上皮和间质型标志物分子的检测，由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，且采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些上皮和间质型标志物在不同癌症类型中表达存在差异，从而会导致一些假阳性和假阴性的检测结果。目前，国内外均没有稳定的用于结直肠癌患者CTCs鉴定和分型的产品。因此，急需一种结直肠癌特异性的分型标志物及能提高现有CTCs检测和分型准确度的检测方法，实现结直肠癌患者CTCs的精确鉴定与分型。
技术实现思路
本专利技术的目的之在于提供一种特异性强、灵敏度高、准确度高的结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有三类：选自CEA、Survivin、MAP2K6、PTPN11中的至少两种的结直肠癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、CDH1、KRT17、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI1、CTNNB1、FN1、TWIST1至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。在其中一个实施例中，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因的mRNA的一类，所述白细胞标志基因为CD45，使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰。在其中一个实施例中，所述结直肠癌细胞标志基因的捕获探针中：针对CEA基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2条或2条以上，针对Survivin基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2条或2条以上，针对MAP2K6基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2条或2条以上，针对PTPN11基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2条或2条以上；针对结直肠癌细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.141；所述结直肠癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.145，P4序列为SEQIDNO.149。在其中一个实施例中，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EpCAM基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2条或2条以上，针对CDH1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2条或2条以上，针对KRT17基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2条或2条以上，针对KRT20基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.142；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.146，P4序列为SEQIDNO.150。在其中一个实施例中，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SNAI1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2条或2条以上，针对CTNNB1基因特异性序列P1选自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2条或2条以上，针对FN1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.143；所述间质细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.147，P4序列为SEQIDNO.151。在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对CD45基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.131～SEQIDNO.140中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.144；所述白细胞标志基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有以下三类：选自CEA、Survivin、MAP2K6、PTPN11中的至少两种的结直肠癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、CDH1、KRT17、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI1、CTNNB1、FN1、TWIST1中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。...

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有以下三类：选自CEA、Survivin、MAP2K6、PTPN11中的至少两种的结直肠癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、CDH1、KRT17、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI1、CTNNB1、FN1、TWIST1中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。2.根据权利要求1所述的结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因的mRNA的一类，所述白细胞标志基因为CD45。3.根据权利要求1所述的结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌细胞标志基因的捕获探针中：针对CEA基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2条或2条以上，针对Survivin基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2条或2条以上，针对MAP2K6基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2条或2条以上，针对PTPN11基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2条或2条以上；针对结直肠癌细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.141；所述结直肠癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.145，P4序列为SEQIDNO.149。4.根据权利要求1所述的结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EpCAM基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2条或2条以上，针对CDH1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2条或2条以上，针对KRT17基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2条或2条以上，针对KRT20基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.142；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.146，P4序列为SEQIDNO.150。5.根据权利要求1所述的结直肠癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SNAI1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2条或2条以上，针对CTNNB1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2条或2条以上，针对FN1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQIDNO.143；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苏燕，吴诗扬，董艳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44