一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，包括以下步骤：(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；(2)选取已发表的127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧木的DNA间的位点多态率；(3)选取与蜡杨梅DNA位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接该接穗。本发明专利技术经过大量实验发现位点多态率与嫁接成活率SR间是显著性负相关，即多态率越高，SR越低。因此选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高，适用作为盐碱地的经济树种。

【技术实现步骤摘要】
一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法
本专利技术涉及一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法。
技术介绍
杨梅(MyricarubraSieb.etZucc.)是中国南方的一种重要的经济作物，距今已有7000年的栽培历史(Jiaoetal.2012)，适合生长在弱酸性的土壤中。2016年浙江全省杨梅面积134.1万亩，产量52.4万吨，产值46.2亿元，其中最著名的两个栽培种是‘荸荠种’和‘东魁’。中国杨梅种类主要包括以下四类：M.rubra，M.esculenta，M.nana和M.adenophora。其他的杨梅种类还有：M.cerifera，M.faya和M.rivas-martinezii(Jiaetal.2015)。Myricacerifera是一种常绿的雌雄异株的植物，多年生灌木，枝干高度可达6米，通常生长在美国东南部沿海地区(Radfordetal.1968)。蜡杨梅果实为单粒种子的核果，果实小，直径4mm，被蜡质类的物质覆盖表面，因此而得名。果实在初秋时节成熟(Ericksonetal.2003)。它与固氮菌(Frankiasp.)共生，可以生长在较为贫瘠的沙质土地上(Youngetal,1992)。盐胁迫是一种影响各类作物生长和产出的非生物胁迫(ShrivastavaandKumar2015)。世界范围内，20％的可耕作土地和33％的可灌溉农业用地均受到高盐害的影响(Panwaretal.2016)。土地盐碱化以每年10％的速度快速增长，预计到2050年盐碱地面积能够达到全部耕地面积的50％(ShrivastavaandKumar2015)。鉴定新型的适应盐碱地的植物可作为一种有效利用盐碱地的方法。以蜡杨梅为砧木以达到高效利用盐碱地的目的。嫁接是一种在果树上广泛应用的农艺技术(Ostendorpetal.2016)。选取具有耐盐碱性，抗病性等品种做为砧木，可以达到提高作物的产量和品质的目的。SSR标记是遗传多样性分析，聚类分析，遗传图谱构建和种质鉴定的首选标记，因为它具有高多态性、共显性及可重复性等特点。SSR标记已被多种果树利用以构建遗传图谱，例如：胡桃(Chengetal.2010；Hanetal.2016),番石榴(Mehmoodetal.2016),苦樱桃(Liangetal.2016),椰子(Kamaraletal.2016),苹果(Okadaetal.2016),枇杷(Fukudaetal.2016)和梨(Nishioetal.2016)等。分子标记在理论研究和分子标记辅助育种中都起着重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的技术目的是：提供一种基于SSR标记预测蜡杨梅为砧木的嫁接成活率的方法。本专利技术选用蜡杨梅作为砧木，以四种当地主栽品种的杨梅(M.rubra)‘荸荠种’(BQ)、‘东魁’(DK)、‘水晶’(SJ)和‘夏至红’(XZH)为接穗进行试验。在过去三年的嫁接试验中，获得了稳定的各嫁接组合的嫁接成活率(SR)，然后利用127对标记对四种接穗与蜡杨梅砧木的DNA进行多态性鉴定，并与SR之间进行相关性分析，结果发现四种接穗与蜡杨梅砧木间的位点多态率与SR间是显著性负相关，即多态率越高，嫁接成活率越低。因此可利用SSR标记来筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗，将待筛选杨梅接穗与腊杨梅砧木的DNA进行多态性鉴定，选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高。本专利技术采用的技术方案是：一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，所述方法包括以下步骤：(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；(2)选取127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧木的DNA间的位点多态率；(3)选取与蜡杨梅DNA位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接该接穗。进一步，所述步骤(1)中，提取DNA的方法为CTAB方法。进一步，选取杨梅枝条的嫩叶，用组织磨样仪(Thmorgan,China)研磨，之后用CTAB方法提取样品DNA(Patersonetal.2003)。由紫外分光光度计和1％的琼脂糖胶电泳测定DNA浓度。所述步骤(2)中，PCR反应体系为10μl体系，包括：DNA1μl，Bluemix(TSINGKE,Hangzhou,China)5μl，Forwardprimer1μl，Reversedprimer1μl，ddH2O2μl.扩增反应由Biometra(America)PCR仪完成，程序为：94℃预变性5min，94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(1min)30个循环，72。C(10min)，最后延伸10℃(1min)。PCR产物电泳检测和银染显色过程参考Zhangetal.(2002)。所述步骤(2)中，采用的127对SSR引物的序列来自于JiaoY,JiaHM,LiXW,ChaiML,JiaHJ,ChenZ,WangGY,ChaiCY,EricvandeWeg,GaoZS.Developmentofsimplesequencerepeat(SSR)markersfromagenomesurveyofChinesebayberry(Myricarubra).BMCGenomics(2012),13:201.所选标记及序列详见表1。表1SSR引物的序列所述步骤(3)中，嫁接的方法为切接，所述切接可以是主干上的切接或在枝条上的切接。本专利技术提供的方法筛选出来的杨梅接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接后，可以种植于盐碱地上，作为沿海地区盐碱滩涂地的经济树种，提高盐碱地的绿化和经济价值，解决了现有杨梅品种不耐盐碱性的问题。本专利技术选用本地普通杨梅和蜡杨梅作为砧木，以BQ、DK、SJ和XZH四种当地的主栽品种作为接穗进行试验。在过去三年的嫁接试验中，获得了稳定的各嫁接组合的SR，然后利用127对标记对四种接穗与蜡杨梅砧木的DNA之间进行多态性鉴定，127对SSR引物共计产生385个多态性位点，每对引物可以产生2-6个不同的位点，并将位点多态率与SR之间进行相关性分析，结果发现位点多态率与SR间是显著性负相关，即多态率越高，SR越低。因此可利用SSR标记来筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗，将待筛选杨梅接穗与腊杨梅砧木的DNA进行多态性鉴定，选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高，适用作为盐碱地的经济树种。附图说明图1砧木主干及枝条上的切接，图中A、B图为主干上的切接，C、D图为枝条上的切接。图2SSR引物(ZJU049)对20份DNA的多态性检测图。具体实施方式下面以具体实施例来对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1材料和方法材料蜡杨梅(Myricacerifera)是一种常绿的雌雄异株植物，多年生灌木，高度可达6米，通常生长在美国东南部沿海地区。蜡杨梅果实为单粒种子的核果，果实小，直径只有4mm，被蜡质类的物质覆盖表面。本研究中，砧木选用M.cerifera和当地杨梅(M.rubra)，选取余姚市的四种主栽品种BQ、DK、SJ和XZH为接穗。这四个品种的果实颜色能够代表杨梅果实的四种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；(2)选取127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧木的DNA间的位点多态率；(3)选取与蜡杨梅DNA位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接该接穗。

【技术特征摘要】
1.一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；(2)选取127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁森苗，戚行江，张淑文，郑锡良，任海英，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33