一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其重链可变区序列包含SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。本发明专利技术以人角蛋白18(CK18)的胞外区多肽为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，得到能够富集肿瘤活细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体的细胞株。本发明专利技术的抗体最大特点在于靶向CK18胞外区，提供足够的亲和力捕获表达CK18的肺癌细胞；且是第一个已知可以应用于活细胞富集捕获的CK18抗体，使之具有用于循环肿瘤细胞(CTC)捕获的潜在可能。

Monoclonal antibody against human keratin 18 for capturing tumor cells and uses thereof

The invention discloses an anti CK18 monoclonal antibody capture tumor cells for the amino acid sequence of the heavy chain variable region sequence containing SEQ ID NO.8 shown in CDR3; and the sequence of the light chain variable region containing SEQ ID NO.15 shows CDR3 amino acid sequence. The present invention in human keratin 18 (CK18) of the extracellular domain of peptides as the immunogen, immunized mice lymphocytes were obtained, and the use of technology to prepare hybridoma cell fusion, can get enrichment of living tumor cells with anti human keratin 18 (CK18) monoclonal antibody cell line. The biggest characteristic of the invention is that antibodies targeting the extracellular domain of CK18, provide sufficient affinity capture CK18 expression of lung cancer cells; and is the first known CK18 antibody can be applied to living cells enrichment capture, which is used for circulating tumor cells (CTC) could potentially capture.

【技术实现步骤摘要】
一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于单克隆抗体生物
，特别涉及一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
角蛋白18(CK18)是一类角蛋白的一种，大小约为48kd；在人体单层上皮组织里面广泛表达，一般和CK8成对出现。CK8/CK18的突变可以引起多种疾病(Gastroenterology2005；129:885)。CK18是多种肿瘤诊断的血清标志物，同时也是肝损伤的血清标志物(AmJClinPathol2005；123:66，ClinBiochem2002；35:327，JHistochemCytochem2005；53:229)；而CK18在乳腺癌中的低表达是不良预后的标志(ClinCancerRes2004；10:2670)。进入人体外周血的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，CTC)。它的捕获、鉴定在肿瘤诊断以及精准医疗指导用药中起到重要的作用。CK18是临床广泛应用的CTC鉴定标志物。目前市场中有大量产品基于抗体捕获循环肿瘤细胞，而大部分是使用抗体偶联其他磁珠等对肿瘤细胞进行富集。但未见使用CK18抗体捕获CTC的产品。市面上现有的CK18抗体，全部没有数据表明可以用于活肿瘤细胞富集，从而限制了市场上的抗体在CTC捕获这个重要领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体，识别并结合人肿瘤细胞膜表面标志物CK18胞外片段的高亲和力鼠单抗，使该抗体能够应用于针对CK18蛋白的活细胞富集、分选、流式细胞术、免疫荧光、免疫共沉淀及WesternBlotting。本专利技术的第二目的在于提供一种上述用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体在富集肿瘤活细胞中的应用，特别是应用于捕获富集表达CK18的肺癌细胞等循环细胞。本专利技术的技术方案如下：本专利技术合成人角蛋白18(CK18)的胞外区多肽，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够富集肿瘤活细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫荧光，免疫共沉淀加质谱和活细胞杂交捕获等验证，确定最有效抗体。一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，所述的抗CK18单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQIDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。优选为，所述的重链可变区序列包含SEQIDNO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQIDNO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQIDNO.11所示的CDR1的氨基酸序列和SEQIDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。优选为，所述的重链可变区序列包含SEQIDNO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQIDNO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQIDNO.11所示的CDR1的氨基酸序列、SEQIDNO.13所示的CDR2的氨基酸序列和SEQIDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。优选为，所述的重链可变区序列的框架区依次包含SEQIDNO.3、5、7和9所示的氨基酸序列，和所述的轻链可变区序列的框架区依次包含SEQIDNO.10、12、14和16所示的氨基酸序列。优选为，所述的重链可变区序列为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本专利技术还公开了上述的用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体在富集肿瘤活细胞中的应用，特别是在捕获富集表达CK18的肺癌细胞等循环细胞上的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：通过实验验证，本专利技术的一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体具有高亲和力，高特异性，多应用场景等特点，最大特点在于靶向CK18胞外区，并且提供足够的亲和力捕获表达CK18的肺癌细胞，且是第一个已知可以应用于活细胞富集捕获的CK18抗体，使之具有用于循环肿瘤细胞(CTC)捕获的潜在可能。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明图1为重组蛋白SDS-PAGE的示意图；图2为PC9人肺癌细胞在克隆号1P1anti-CK18抗体的内源蛋白印记WB验证示意图；图3为PC9人肺癌细胞在克隆号1P1anti-CK18抗体的免疫荧光IF验证示意图；图4为PC9人肺癌细胞与克隆号1P1anti-CK18抗体的杂交原理示意图；图5为PC9人肺癌细胞与克隆号1P1anti-CK18抗体的捕获富集示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限定本专利技术的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本专利技术做出的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术未特别的说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段，且所用的原料、试剂也均为市售可购买得到的商品。实施例1一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗CK18单克隆抗体的制备和纯化1.1抗原的制备合成人CK18胞外区多肽’LEDGEDFNLGDALD’作为免疫原，该多肽偶联了VLP以及传统KLH系统的免疫原性增强因子。1.2免疫小鼠每组抗原将用来免疫6只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。每个6免疫原多肽混合成一组。每个可溶片段免疫原单独为一组。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(重组蛋白作为抗抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。CK18重组蛋白由上海交通大学系统生物医学研究院癌基因及相关基因国家重点实验室提供，蛋白序列取自UniProtP05783：MSFTTRSTFSTNYRSLGSVQAPSYGARPVSSAASVYAGAGGSGSRISVSRSTSFRGGMGSGGLATGIAGGLAGMGGIQNEKETMQSLNDRLASYLDRVRSLETENRRLESKIREHLEKKGPQVRDWSHYFKIIEDLRAQIFANTVDNARIVLQIDNARLAADDFRVKYETELAMRQSVENDIHGLRKVIDDTNITRLQLETEIEALKEELLFMKKNHEEEVKGLQAQIASSGLTVEVDAPKSQDLAKIMADIRAQYDELARKNREELDKYWSQQIEESTTVVTTQSAEVGAAETTLTELRRTVQSLEIDLDSMRNLKASLENSLREVEARYALQMEQLNGILLHLESELAQTRAEGQRQAQEYEALLNIKVKLEAEIATYRRLLEDGEDFNLGDALDSSNSMQTIQKTTTRRIVDG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述的抗CK18单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述的抗CK18单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQIDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述的重链可变区序列包含SEQIDNO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQIDNO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQIDNO.11所示的CDR1的氨基酸序列和SEQIDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述的重链可变区序列包含SEQIDNO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQIDNO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQIDNO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可...

【专利技术属性】
技术研发人员：王朝晖，侯冰，孟逊，
申请(专利权)人：艾比玛特医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31