基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒技术方案

本发明专利技术涉及一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，属于生物检测领域。包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS‑T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、终止液，以及10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425‑600μm玻璃珠，应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。本发明专利技术可用于绵羊白细胞、血清、血浆及其它组织样品中Prdx6含量测定，灵敏度达pg级。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物快速检验检疫领域，通过构建绵羊过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin6，Prdx6)重组表达质粒，制备绵羊Prdx6重组蛋白(rOaPrdx6)，利用特异性兔源抗绵羊Prdx6多克隆抗体和特异性鼠源抗绵羊Prdx6单克隆抗体，及优化样品前处理程序，以生物素-链霉亲和素(Streptavidin)-生物素(Biotin)-碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)BSaBA信号放大系统为基础，建立一种绵羊Prdx6含量测定双抗体夹心ELISA方法，并将其组装成易于使用的Prdx6含量测定试剂盒。
技术介绍
过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin6，Prdx6)广泛存在于原核和真核生物的细胞质中。其具有多种生物学功能，例如参与细胞增殖分化、保护自由基敏感蛋白、增强NK细胞的活性、介导哺乳动物细胞信号传导等。主要功能是利用硫氧还原蛋白将过氧化物以及超氧化物进行还原，消除代谢产生的过氧化物。病原微生物侵入生物机体后，能够被吞噬细胞吞噬并导致大量活性氧(ROS)的产生，达到杀灭病原微生物的目的。通过这个过程可以将大部分的病原微生物清除，但是仍然有某些细胞内寄生菌可以逃避吞噬细胞的杀伤作用而存活在细胞内。其中过氧化物氧化还原酶家族(Peroxiredoxins,Prdxs)对ROS的清除可能是胞内寄生菌抵抗ROS氧化损伤作用，得以完成细胞内寄生的重要免疫逃避机制之一。Prdx6是Prdxs家族中的一员，可有效使ROS失活，有可能被胞内寄生菌利用达到清除胞内活性氧完成胞内寄生的目的。近几年研究还发现Prdx6除抗氧化作用外，还与糖尿病、癌症发生发展、脑和肺疾病、以及多种细胞因子的分泌与免疫损伤有关。因此，Prdx6有可能成为某些疾病诊断的生物标志分子。因此建立一种准确、快速检测组织细胞中Prdx6含量的检测方法，并组装成易于使用的Prdx6含量测定试剂盒能够为评估机体健康水平和抗氧化应激能力提供有效工具。布鲁氏菌病(Brucellosis，布病)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的严重危害公共卫生的人兽共患传染病。本课题组前期研究发现，绵羊白细胞层基因表达谱在布鲁氏菌强毒株感染与疫苗接种两种情况下发生变化。通过Real-timePCR证实，与健康羊相比，自然感染强毒株绵羊白细胞中Prdx6上调表达，而疫苗接种绵羊白细胞Prdx6基因的表达水平与强毒株感染存在差异。推测宿主Prdx6差异表达可能与布鲁氏菌的胞内寄生与增殖存在一定的相关性。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，以解决现有Prdx6含量测定ELISA方法不能检测绵羊Prdx6含量、以及检测限无法检测血清中Prdx6含量的问题，本专利技术通过构建绵羊过氧化物氧还酶6(OaPrdx6)重组表达质粒，制备绵羊Prdx6重组蛋白(rOaPrdx6)，利用特异性兔源抗绵羊Prdx6多克隆抗体和特异性鼠源抗绵羊Prdx6单克隆抗体，优化样品前处理程序，以BSaBA信号放大系统为基础，建立一种绵羊Prdx6含量测定双抗体夹心ELISA方法，并组装成易于应用的Prdx6含量测定试剂盒。可检测血清、白细胞、组织器官中Prdx6含量，同时可进一步探讨用于检测牛源、鼠源Prdx6含量。本专利技术采取的技术方案是：包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS-T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3MNaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。本专利技术所述绵羊Prdx6重组蛋白是通过原核表达系统制备的，所述的原核表达系统是由下列步骤得到的：(1)提取羊血液白细胞层细胞总RNA反转cDNA为模板，进行PCR扩增，获得绵羊Prdx6基因，克隆到pMD18-T-Simple载体上，之后将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；(2)将pET-30a-OaPrdx6转化至E.coliBL21-Codonplus细胞中诱导表达重组绵羊Prdx6蛋白，挑取经鉴定确证的单菌落，接种于5mL含50mg/L卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养2h，然后按1:500比例接种于200mL的含50mg/L卡那抗性的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养1h，加终浓度0.4mM的IPTG,继续振荡培养5.5h后，离心收集菌体；(3)菌体重悬于上样缓冲液，该缓冲液包括20mM磷酸钠，30mM咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0，超声裂解后，10000g离心15min，取上清，经镍柱纯化，上样后继续加入约10个柱体积的上样缓冲液；用洗脱液洗脱，该洗脱液包括20mM磷酸钠，0.5M咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0；用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液为0.01MpH8.0的PBS，更换5次透析液，每2h换一次，用PEG20000进行浓缩，透析去除小分子，经SDS-PAGE鉴定纯度后,分装、放入-80℃冰箱备用。本专利技术所述所述基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述BSaBA检测信号放大系统是由下列步骤得到的：每孔加入100μL0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗结合检测用鼠单克隆抗体，37℃反应1h，洗孔3-4次，按分子数摩尔比1:2-3加入100μLSaBA复合检测液结合生物素标记的羊抗鼠二抗，37℃反应30min，洗孔3-4次，加入100μL1g/L对硝基苯磷酸盐(PNPP)37℃放置15min显色，再加入100μL3MNaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度值；所述SaBA复合检测液制备是在pH7.4磷酸盐缓冲体系中，将链霉亲合素和碱性磷酸酶标记的生物素以分子数比1:2-3的比例混合，制得。本专利技术所述所述稀释液为1％脱脂乳PBS溶液，pH7.4。本专利技术所述捕获用兔源多克隆抗体包被的酶标板制备步骤如下：(1)用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液做为包被液，将捕获抗体稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；(2)取出预包被酶标板，用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；(3)每孔加入200μL0.1M氯化铵封闭液，37℃孵育1h；(4)用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；(5)吹干兔源多克隆抗体包被的酶标板，铝铂袋密封包装备用。本专利技术所述血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠应用于血液中白细胞处理步骤中，具体如下：(1)10×红细胞裂解浓贮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS‑T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3M NaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425‑600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS-T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3MNaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。2.根据权利要求1所述的基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于绵羊Prdx6重组蛋白是通过原核表达系统制备的，所述的原核表达系统是由下列步骤得到的：(1)提取羊血液白细胞层细胞总RNA反转cDNA为模板，进行PCR扩增，获得绵羊Prdx6基因，克隆到pMD18-T-Simple载体上，之后将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；(2)将pET-30a-OaPrdx6转化至E.coliBL21-Codonplus细胞中诱导表达重组绵羊Prdx6蛋白，挑取经鉴定确证的单菌落，接种于5mL含50mg/L卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养2h，然后按1:500比例接种于200mL的含50mg/L卡那抗性的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养1h，加终浓度0.4mM的IPTG,继续振荡培养5.5h后，离心收集菌体；(3)菌体重悬于上样缓冲液，该缓冲液包括20mM磷酸钠，30mM咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0，超声裂解后，10000g离心15min，取上清，经镍柱纯化，上样后继续加入约10个柱体积的上样缓冲液；用洗脱液洗脱，该洗脱液包括20mM磷酸钠，0.5M咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0；用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液为0.01MpH8.0的PBS，更换5次透析液，每2h换一次，用PEG20000进行浓缩，透析去除小分子，经SDS-PAGE鉴定纯度后,分装、放入-80℃冰箱备用。3.根据权利要求1所述基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述BSaBA检测信号放大系统是由下列步骤得到的：每孔加入100μL0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗结合检测用鼠单克隆抗体，37℃反应1h，洗孔3-4次，按分子数摩尔比1:2-3加入100μLSaBA复合检测液结合生物素标记的羊抗鼠二抗，37℃反应30min，洗孔3-4次，加入100μL1g/L对硝基苯磷酸盐(PNPP)37℃放置15min显色，再加入100μL3MNaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度值；所述SaBA复合检测液制备是在pH7.4磷酸盐缓冲体系中，将链霉亲合素和碱性磷酸酶标记的生物素以分子数比1:2-3的比例混合，制得。4.根据权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为1％脱脂乳PBS溶液，pH7.4。5.根据权利要求1所述的一种基于BSaBA...

【专利技术属性】
技术研发人员：任洪林，马晓龙，卢士英，柳增善，胡盼，刘楠楠，柳溪林，李岩松，周玉，陈晓峰，刘东，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22