本发明专利技术公开了检测E种肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，它采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的VP1基因，表达的VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制备的多克隆抗体为捕获抗体，采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示的VP2基因，表达的VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制备的单克隆抗体，并标记了辣根过氧化物酶（HRP）。安全性、与RT-PCR检测结果具有100%符合率。试剂盒4℃保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，具体涉及检测E种肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂 盒。
技术介绍
牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)与人脊髓灰质炎病毒、人柯萨奇病毒、人 肠道致细胞病变孤儿病毒，猪肠道病毒等同属小RNA病毒科肠道病毒属中的成员，它所引起 的传染病给养牛业造成严重的经济损失。牛肠道病毒感染临床上以发热、流泪、咳嗽、流鼻 涕、呼吸困难和严重腹泻为主要特征。本病自上世纪50年代首次由Moll等报道以来，其他国 家也相继报道有本病发生。国内李英利等于2011年首次从内蒙某奶牛场的犊牛粪便样品中 分离到一株F种肠道病毒，证实国内牛群中存在BEV感染。彭小薇等于2013年从北京地区某 发生严重腹泻的奶牛也分离出一株F种牛肠道病毒。申请人于2012年从吉林长春地区爆发 的一种临床上以呼吸困难和严重腹泻，高发病率和高致死率为主要特征的不明疫病中首次 发现分离出E种肠道病毒HY12,确定了国内牛群存在E种肠道病毒感染。该病在国内为新发 传染病，严重威胁养牛业的健康发展。有关BEV感染的诊断方法，尤其是具有特异、敏感、快 速与简便、适于在基层牛场应用的检测肠道病毒抗原的方法和试剂盒鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种检测E种肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂盒。 一种E种肠道病毒抗原捕获抗体，它是采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示 的VPl基因，表达VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制备的多克隆抗体。 -种E种肠道病毒酶标抗体，是采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2 基因，表达VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制备的单克隆抗体。 所述的一种E种肠道病毒酶标抗体标记了辣根过氧化物酶。 检测E种肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，它的抗原捕获抗体为上述的一 种E种肠道病毒抗原捕获抗体，酶标抗体为上述的一种E种肠道病毒酶标抗体。 本专利技术提供了检测E种肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，它采用其碱基序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示的VPl基因，表达的VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制备的多克隆 抗体为捕获抗体，采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2基因，表达的VP2蛋白， 免疫BALB/C小鼠后制备的单克隆抗体，并标记了辣根过氧化物酶(HRP)。安全性、与RT-PCR 检测结果具有100%符合率。试剂盒4°C保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异。 本专利技术的优点： 1、 具有生物安全性。试剂盒所用的抗E种肠道病毒VPl和VP2的高免抗体为原核载体表 达的重组蛋白诱导BALB/C小鼠产生，不含E种肠道病毒，因此不存在散毒危险； 2、 敏感性高。捕获抗体和HRP标记二抗均具有很高的免疫效价，因此提高了试剂盒的敏 感性和特异性。试剂盒检测E种肠道病毒阳性和阴性粪便样品与RT-PCR检测结果具有100% 符合率； 3、 特异性强。试剂盒与其他病原体无交叉反应，只检出E种肠道病毒抗原，具有很高特 异性； 4、 稳定性好。试剂盒4°C保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异，具有很好的稳定 性； 5、 快速简便。试剂盒2.0-2.5 h即可报告结果，使用方便，一般技术人员按说明书即可 操作，条件一般实验室均可进行； 6、 不影响动物正常生产。待检样品为粪便，采集容易、方便、不影响动物正常生产，容易 被基层牛场接受； 7、 价格便宜。约3元/头份，HRP标记二抗和抗体制备技术成熟，均可大规模获得。【附图说明】图I PGEX-4T-1-VP1 和PGEX-4T-1-VP2重组质粒酶切鉴定（泳道2、3:pGEX-4T-1-VPl;泳道5、6: PGEX-4T-1-VP2;泳道1、7: PGEX-4T-1 质粒阴性对照；泳道4: DNA分子marker); 图2重组蛋白的SDS-PAGE检测结果(泳道3: pGEX-4T-1-VP 1重组菌未诱导总蛋白；泳道 2:pGEX-4T-1-VPl重组菌诱导后总蛋白；泳道4:pGEX-4T-1-VP2重组菌未诱导总蛋白；泳道 5:pGEX_4T-l_VP2重组菌诱导后总蛋白；泳道1、6:蛋白分子marker); 图3纯化重组蛋白的SDS-PAGE检测结果(VP1重组蛋白BSA;VP2重组蛋白BSA); 图4 E种肠道病毒VPl和VP2抗体免疫荧光鉴定； 图5试剂盒各组分（（1)包被有VP1捕获抗体及预处理的96孔ELISA板；（2)样品稀释液； (3)20倍浓缩洗涤液；（4)HRP标记抗VP2 IgG; (5)终止液；（6)底物A; (7)底物B; (8)阳性对照 样品；（9)阴性对照样品）。【具体实施方式】实施例1 E种肠道病毒结构蛋白VPl和VP2原核表达重组质粒的构建 1、 引物设计 根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增VPl和VP2基因的引物，上下游分别含有 BamHI、EcoR頂每切位点。引物序列如下： 扩增VPl序列引物：2、 基因扩增 常规Trizol法提取E种肠道病毒的基因组RNA，采用市售常规反转录试剂盒，按照说明 操作获得cDNA，并以其为模板分别扩增了 VPl基因和VP2基因，PCR反应体系：PCR 运行条件：94°C 预变性 2min;94°C 变性 lmin、54°C 退火 30sec、72°C 延伸 30sec，共 30 个循环;72°C再延伸5min。反应结束后，取IyL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 3、目标基因与pGEX-4T-l的连接、转化 采用分子生物学领域中的常规酶切、连接等技术，构建重组质粒PGEX-4T-1-VP1和 PGEX-4T-1-VP2,并采用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态中。利用含100 yg/mL 氨苄霉素的LB培养平板筛选阳性克隆，并进行常规增菌培养，收获菌体，提取质粒，进行 BamHI/EcoRI双酶切鉴定，如图1所示。 实施例2 VPl和VP2重组蛋白的表达及纯化 将鉴定的阳性重组质粒PGEX-4T-1-VP1和pGEX-4T-1-VP2转化BL21(DE3)感受态细胞 后，挑取单个菌落接种到3 mL含有100 yg/rnL氨苄霉素的LB液体培养基中培养过夜，然后取 I mL上述培养物接种到200 mL含有100 yg/rnL氨苄霉素的LB液体培养基中37°C振摇培养至 对数生长期（OD6QQ=O . 6~0.8)，加入IPTG至终浓度为I mmol/L，20°C诱导培养3 h，经SDS-PAGE检测，获得了重组目标蛋白VPl和VP2,如图2所示。离心沉淀菌体，超声破碎后以尿素纯 化包涵体方法获得高纯度的重组蛋白，如图3所示。实施例3抗VPl鼠源多克隆抗体和VP2单克隆抗体的制备与纯化 1、 抗VPl鼠源多抗制备:选择6-8周龄健康BALB/C小鼠，以弗氏完全佐剂乳化纯化的VPl 重组蛋白，每只小鼠多点皮下注射共100 yg，之后每间隔14 d按照同样方法加强免疫一次， 同时采集血清检测效价。最后一次加强免疫采用直接腹腔注射100 yg纯化的蛋白，3~5 d后 采集血液收集血清，即为抗VPl鼠源多抗； 2、 抗VP2单克隆抗体制备：免疫方法同抗VPl鼠源多抗制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种E种肠道病毒抗原捕获抗体，它是采用其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的VP1基因，表达VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠制备的多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王新平，邢泽黎，朱利塞，郭昌明，盖小春，王明月，鲁海冰，曹玉峰，刘亚静，张群，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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