本发明专利技术公开了一种针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒。所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQ ID NO：2所示；然后免疫新西兰白兔。ELISA双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm。所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质量。本发明专利技术为蜂蜜质量及掺假量检测提供了一种可靠的快速检测新方法，可用于蜂产品质量监管部门、加工贸易企业蜂蜜产品质量控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蜂蜜成分含量的测定技术，尤其涉及一种蜂蜜所含的由蜜蜂封后分泌的内源性蜂王浆主蛋白MRJP1特异性双抗体的制备方法，及用双抗体检测掺假蜂蜜的双抗体夹心方法等。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂工蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾中经充分酿造形成的天然甜物质。我国是蜂蜜生产和出口大国，2012年全国产量达到45.16万吨，占世界蜂蜜总产量的1/4；2013年出口蜂蜜12.5万吨，占世界蜂蜜贸易量的1/4。根据中华人民共和国供销合作行业标准GH/T18796-2012《蜂蜜》对蜂蜜真实性的描述，“蜂蜜中不得添加任何当前明确或不明确的添加物；如果在蜂蜜中添加其它物质,不应以’蜂蜜’或’蜜’作为产品名称或名称主词；采用我国国家标准GB/T18932.1(2012)《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》方法检测，蜂蜜中的碳-4植物糖含量不得大于7。”由于蜂蜜掺假成本低廉，检测困难，不法商贩容易牟利，已严重扰乱蜂蜜市场秩序，导致产品信任度严重下降，导致行业整体价格和效益下降。目前市场上最常见的蜂蜜掺假方式是加入果葡糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆等，尤其是用大米糖浆勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风味完全可以通过欧盟标准，难以检测，严重影响了我国国际贸易声誉。近年来，蜂蜜市场鱼龙混杂，掺假造假的事件不断被曝出。2015年3月，在十二届全国人大三次会议上，10名全国人大代表提交了“严厉打击假劣蜂产品的建议”。2015年7月，国家食品药品监督管理总局在其官网正式作出回应：现行蜂蜜国家标准无法鉴别蜂蜜的真假，将积极推动蜂蜜食品安全国家标准的修订和蜂蜜掺假补充检验方法的建立。为打击掺假蜂蜜，多年来国内外开展了大量以掺假物质：来自于甘蔗和玉米等碳四植物蔗糖和高果糖浆，来源于碳三植物的大米糖浆为指标的检测方法研究。由于蜜蜂采集的花粉来自于碳三植物，与甘蔗和玉米这两类植物产生的糖中C13同位素的比例不一样。理论上可用碳四植物糖的同位素检测方法确定蜂蜜的“真假”。但不同的蜂蜜差异实在太大，C13同位素偏移的范围也很大，很难准确判断真假。有了碳四检测法后，一些不良商家便开始改为添加碳三糖，常见就是用碳三植物源的大米糖浆和甜菜糖浆，如果在蜂蜜中掺入大米糖浆，碳四检测方法就无能为力了。随后专利技术了用高效液相色谱质谱联用(LC-MS)仪来检测大米糖浆。但如果把大米糖浆水解转化成葡萄糖和果糖，即便同时使用碳四检测和LC-MS仪检测，都无法辨别是否掺假。我国曾先后颁布了GB/T18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法》、GB/T18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》、GB/T18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》等多项检测方法标准。国内外已报道的检测掺假蜂蜜技术有：（1）液相色谱-同位素比率质谱联用（LC-IRMS）：通过对蜂蜜样品中的蔗糖、葡萄糖、果糖和蛋白质的δ13C进行分析，发现Δδ13C[果糖-葡萄糖]、Δδ13C[果糖-蔗糖]、Δδ13C[葡萄糖-蔗糖]可以指示掺假蜂蜜中的外源糖类，有效识别出C3糖（甜菜糖）和C4糖（蔗糖、蔗糖糖浆、高果玉米糖浆）(Cabaneroetal,2006)。（2）液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法（LC/EA-IRMS）：发现纯正蜂蜜样品Δδ13C[蛋白质-蜂蜜]≥-0.95‰，Δδ13C[果糖-葡萄糖]在-0.64‰~0.53‰之间(费晓庆等,2011)。（3）光谱技术鉴别：陈兰珍等采用近红外光谱分析（NIR）与DPLS化学计量学结合的方法建立了5组数学模型，以C4植物糖检测结果为判定依据，进行了蜂蜜样本识别(陈兰珍等,2008)。Kelly等利用用户傅里叶变换-拉曼光谱法，并结合SIMCA分类法检测了掺入C3甜菜糖浆和C4高果玉米糖浆的蜂蜜样品，进行了蜂蜜真伪鉴定，并用PLS法预测了掺假水平(Kelly等,2006)。（4）核磁共振法（NMR）：Bertelli等利用一维和二维核磁共振法，结合多变量统计分析，检测蜂蜜中掺入不同浓度的糖浆(Bertellietal,2010)。Spiteri等用1H-NMR对采自全球范围内的800余个蜂蜜样品进行了分析，在200余份样品中发现了糖浆成分(Spiterietal,2015)。（4）蜂蜜元素组成分析：吴招斌等采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）结合主成分分析和判别分析，测定了洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中20种矿物质元素含量，用筛选出Mg、Sr、Ba、Ni、Sb、Cr和Na7种矿物质元素建立判别模型，利用该模型对蜂蜜品种作了鉴别(吴招斌等,2015)。桂茜雯等采用ICP-MS测定了大米糖浆和纯正蜂蜜中砷的含量，发现纯蜂蜜与大米糖浆中的砷元素含量相差10倍以上，纯蜂蜜中砷含量均低于15μg/kg，确定蜂蜜中砷含量超过15μg/kg为大米糖浆掺假蜂蜜(桂茜雯等,2014)。但由于蜜蜂中的掺假方法和掺假成分多，用检测外源成分鉴别假蜂蜜需要同时采用多种方法，单一方法很难凑效。同时，以上各种方法需要采用昂贵的精密仪器，检测成本很高。我国以往公布的专利技术专利申请中，基本涵盖了以上论文报道所述的液相色谱、质谱、近红外光谱测定掺假外源糖类的方法。其中胡福良等申请的专利技术专利“一种蜂蜜真伪的鉴别方法及应用”（申请号：201110067242.9）报道了用分光光度计检测蜂蜜有无β-葡萄糖苷酶活力来鉴别掺假蜂蜜的方法，但迄今未见实际应用。为此，国外科学家开始探索以蜂蜜内源成分王浆主蛋白【MajorRoyalJellyProteins(MRJPs)（LenskyandRakover1983,CompBiochemPhysiol.75:607-615）】为指标的掺假蜂蜜检测方法。王浆主蛋白属于水溶性蛋白，是蜜蜂工蜂头部王浆腺蜂蜜物蜂王浆的主要活性成分，约占蜂王浆总蛋白的46%-89%(Tomoda等.1977,JApicRes.16:125-130;TakenakaandEchigo1983,NipponNogeikagakuKaishi.57:1203-1209)。目前已通过对西方蜜蜂基因组研究确定，MRJPs家族有9个成员，即MRJP1~MRJP9(Drapeauetal.2006，GenomeResearch,16:1385-1394)，其分子量范围在25~87kDa。在MRJPs家族中，分子量为55-57的MRJP1（或者Albumin-1）是含量最高的蛋白质，约占水溶性蛋白（MRJPs家族）的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法，其特征在于，所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQ ID NO：2所示；然后免疫新西兰白兔。
【技术特征摘要】
1.一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法，其特征在于，所述的MRJP1的特异性
多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQIDNO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5
的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDNO：2所示；然后免疫新西兰白兔。
2.一种针对蜂蜜中内源MRJP1的免疫检测方法，其特征在于，
1）利用MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体，MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测
抗体，以免疫双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量；
所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-1通过利用MRJP1特异性多肽M4免疫新西兰白兔得
到；所述的MRJP1特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQIDNO：1所示；
所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-2通过利用MRJP1特异性多肽M5免疫新西兰白兔得
到，所述的MRJP1特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDNO：2所示。
3.根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的免疫双抗夹心法为ELISA
双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的
检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450nm-
630nm。
4.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈立荣，王一然，谌迪，张一帆，沈苗宏，辛晓璇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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