一种检测天然肺癌相关抗体的组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测天然肺癌相关抗体(LCAA)的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测血浆中天然LCAA浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在检测血浆天然LCAA中的应用。本发明专利技术利用与目标天然LCAA完全互补的6种线性抗原多肽,实现对血浆中天然LCAA的定性、定量检测，可用于区分富含天然LCAA的血浆(阳性)和不含天然LCAA的血浆(阴性)。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学
，涉及6种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)抗体检测试剂盒，用于检测血浆中天然肺癌相关抗体(lungcancer-associatedantibody,LCAA)浓度。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁整个人类健康的最主要杀手之一。基于灰霾雾霾等环境污染状况的持续存在，中国人群主要癌症的发病率呈逐年上升趋势。据统计，目前我国癌症平均每年发病率高达3/1000以上。肿瘤早期治疗手段，如手术切除或放射线治疗已发展的比较成熟，能够明显延长病人的存活时间。但是，如何预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤是有效防治肿瘤的重要途径。先前的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在国外,已有早期诊断肺癌和乳腺癌的诊断试剂盒市售。例如，由英国诺丁汉Oncimmune有限公司推出的EarlyCDTTM-Lung诊断试剂盒已在北美和欧洲用于临床早期诊断肺癌近6年。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度相对低，特异性差，假阴性比率可高达60％以上。其中主要原因，是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者血中的阳性检测率平均在10％左右，即便是多种抗原混合，阳性检测率也难以突破50％。近年来有关天然抗体研究报道显示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由B1淋巴细胞产生,不需要特异性抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,并且充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。特别值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,以维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏或阴性者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。
技术实现思路
本专利技术人研究发现，健康人体内会自然形成多种肿瘤相关抗体，例如与肺癌关相的抗白介素2受体A(Interleukin-2receptorsubunitalpha，IL-2Rα或CD25)抗体，抗叉头蛋白3(Forkhead/wingedhelix，FOXP3)抗体，抗肿瘤坏死因子A(Tumornecrosisfactoalpha,TNFα)抗体，抗转录因子c-MYC蛋白(transcriptionfactorc-MYC,MYC)抗体，抗膜粘连蛋白I(AnnexinA1，ANXA1)抗体和抗细胞凋亡抑制基因5(BaculoviralIAPrepeat-containing5,BIRC5)抗体等。因此，本专利技术的主要目的是提供一组用于检测人血浆中天然LCAA浓度的线性抗原多肽和由此制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血浆中天然LCAA的方法。所述抗原多肽为衍生于CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白的抗原表位。这些抗原表位能够与针对人血浆中抗CD25、抗FOXP3、抗TNFα、抗MYC、抗ANXA1和抗BIRC5的天然LCAA发生特异性结合。本专利技术所定义的“肺癌相关抗体(LCAA)”是自然存在于健康人体内的抗体或抗体混合物，可能参与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生。检测天然LCAA具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在本专利技术的特定实施方案中，所述天然LCAA是指能识别SEQIDNO:1-6中的一个或多个表位序列的天然抗体或天然抗体混合物。本专利技术人利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(HumanleukocyteantigenII,HLA-II)表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体(待检测样品中的抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇可代表整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。本专利技术根据CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白的生物学特性，针对这六种蛋白的多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了六种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表1。表1.检测人血浆中天然LCAA的线性抗原多肽序列经固相化学法合成上述6种抗原多肽，并按比例混合后制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测健康个体血浆中天然LCAA浓度。上述6种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4℃环境下可保存6个月以上。简言之，可将6种多肽抗原混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板在45度(45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选6种多肽抗原均为纯度>90％的制品。因此，根据本专利技术之一，提供了一种用于检测天然LCAA的组合物，其包括如下6种抗原多肽：H-DCKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKL-OH；H-EPDDDPMQRKPTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWL-OH；H-CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV-OH；H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV-OH；H-DWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD-OH；H-DVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKCD-OH。在一些实施方案中，所述6种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>90％的化学合成制品。在一些实施方案中，所述组合物中6种抗原多肽的比例为1:1:1:1:1:1(浓度比)。根据本专利技术的另一个方面，提供一种用上述组合物制成的试剂盒。在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将6种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。根据本专利技术的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测样品中天然LCAA的方法，优选该方法为体外的、非诊断目的的检测技术。在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的6种抗原多肽等比混合，然后通过抗原抗体结合反应检测待测样品中天然LCAA浓度。在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测个体血浆中天然LCAA浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。在更优选的实施方案中，将上述组合物中的4种抗原多肽等比混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4度过夜孵育，洗板，再对待测样品进行检测分析。在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测天然LCAA的组合物，包括如下6种抗原多肽:H‑DCKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKL‑OH；H‑EPDDDPMQRKPTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWL‑OH；H‑CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV‑OH；H‑RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVD‑OH；H‑DWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD‑OH；H‑DVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKCD‑OH。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测天然LCAA的组合物，包括如下6种抗原多肽:H-DCKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKL-OH；H-EPDDDPMQRKPTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWL-OH；H-CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV-OH；H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVD-OH；H-DWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD-OH；H-DVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKCD-OH。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中各抗原多肽混合浓度比例为1:1:1:1:1:1。3.由权利要求1或2的组合物制成的试剂盒。4.根据权利要求3的试剂盒，将6种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装，制成试剂盒。5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述材料为玻璃或医用塑料。6.一种体外的非诊断目...

【专利技术属性】
技术研发人员：尉军，孟庆勇，
申请(专利权)人：长春市海兰深生物医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22