基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法及试剂盒，其包括步骤：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程、量子点荧光探针的制备过程和往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞的荧光图像；通过量子点标记抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体可组成液态芯片或免疫荧光检测结直肠癌细胞或蛋白免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高和特异性好的优点，并且能快速、准确检测及能检测分泌物包括粪便和血清能够极大的提高结直肠癌的检测准确度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及结直肠癌细胞的检测方法
，尤其是涉及基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法。本专利技术还涉及结直肠癌的检测试剂盒技术，尤其是包含有单克隆抗体33.26和单克隆抗体31.3的试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是世界上常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率排第三位，近年来，随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，其发病率呈明显上升趋势。但是，目前国内外对结直肠癌的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者明确诊断时已进入中期和晚期结直肠癌。因此，提高结直肠癌的早期诊断是目前国内外迫切需要解决的关键问题。目前早期诊断结直肠癌有以下几种的常用技术：(1)大便隐血试验是结肠癌常用的筛查方法，操作简便、无创，主要缺点是灵敏度低、特异性差。(2)电子结肠镜(简称内镜)是发现及诊断结直肠癌最有效的手段，也是目前早期诊断结直肠癌的主要方法，尤其是在高危人群的检查具有重要的临床价值。因其为创伤性检查伴有出血、肠穿孔等危险的副作用、且需要一定的设备和仪器，对操作人员的专业水平要求较高，故在大范围人群的检查存在着很大的局限性。(3)电化学发光技术检测常用肿瘤标记物：如CEA、CA199、CA242、CA50，因其阳性率低，缺乏特异性(66.7％)，不合适用于结直肠癌的早期诊断。(4)采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但它们在应用于结直肠癌的早期诊断方面还有待于进一步研究。近年来，国内外学者开始致力于寻找敏感、特异、可靠、有效的结直肠癌新生物标记物以及建立无创伤性检查和实验方法来提高早期诊断结直肠癌的诊断率。近年来有研究显示，M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在胃肠肿瘤的发生、发展和代谢中发挥重要的作用。与正常组织相比，胃癌组织中M2-PK表达升高，与患者低生存率相关。国外学者认为肿瘤M2-PK在血浆、粪便检测其灵敏度(90.7％)和特异性(96.3％)较高，且与疾病分期和淋巴结转移相关，有望成为结直肠癌新型肿瘤标记物，尤其是在粪便的检测其临床价值更大。M2-PK主要以两种形式存在，即前者主要存在于分化的组织和正常增殖的细胞中，而后者常存在于肿瘤细胞中，与底物亲和力低，促使肿瘤细胞内糖代谢中间体如磷酸烯醇类物质等积累，对肿瘤细胞的增殖具有重要作用。当肿瘤发生时往往伴随二聚体形式的M2-PK含量增加。随着技术的发展，量子概念也浸入了医学领域。量子点Quantumdots，QDs)又称半导体纳米微晶体(Semiconductornanocrystals)，是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子。量子点具有一般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子尺寸效应，具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性。正是基于量子点独特的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学以及蛋白质组学等研究中有着极大的应用前景。量子点纳米标记荧光不仅能特异性靶向肿瘤部位，还能通过荧光强弱反映出其活跃程度，可应用于肿瘤的早期诊断和监测疗效。由于结直肠癌在遗传学上是多步骤、多阶段、多基因改变的过程，多基因联合检测对提高检出率及检测敏感性更有重要意义。结直肠癌是一种多基因性疾病，在发生发展过程中涉及到相关基因的改变如：K-ras、APC等基因突变。国外学者报道K-ras基因突变与结直肠癌密切相关，是结直肠癌的早期分子事件。APC基因突变与早期结直肠癌和腺瘤的诊断有较大的临床价值，尤其是在高危人群早期诊断具有重要意义。近年来我国学者提出富含亮氨酸重复测序G蛋白耦联受体5(LGR5)，是一种干细胞分子标记物，也是Wnt信号通路的靶基因之一，其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新，LGR5在结直肠癌组织中呈高水平的表达。目前有研究提出AKT和PI3K基因突变可作为肿瘤的早期诊断、确定肿瘤的浸润范围以及判断预后的重要指标。近年来，有研究表明MXRAS有可能成为对大肠癌前病变早期诊断的有实用价值的肿瘤标记物。因此急需一种能够是实现与肿瘤细胞紧密结合的荧光探测技术，尤其是能够利用量子点技术，能够准确实现对结直肠癌的检测的技术。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的不足，提出一种能够实现对M2丙酮酸激酶进行准测检测的方法以及提供一种用于检测结直肠癌细胞的试剂盒。为了解决上述的技术问题，本专利技术提出的基本技术方案的一个方面为：一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，包括步骤：A：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程小鼠免疫：以基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1×106以上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组合液，产生抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得一株M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株；单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株制备腹水获得单克隆抗体33.26，在第二小鼠体内接种M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株制备腹水获得得到单克隆抗体31.3；B：量子点荧光探针的制备过程对QD605溶液进行量子点活化；经过量子点活化的QD605的溶液与抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体通过非共价偶联形成量子点荧光探针；C：往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞的荧光图像或者通过计算机分析荧光图像以判断结果。本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，所述基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白由携带M2丙酮酸激酶蛋白基因的大肠杆菌的工程菌株制配制而得。本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，小鼠免疫过程中，所述第一小鼠和第二小鼠为4-6周的雌性小鼠，对第一小鼠和第二小鼠进行第一次注射免疫时，采用弗氏完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg；以后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳化后对第一小鼠和第二小鼠进行注射免疫，一共注射免疫4次后，于融合前的3天，对第一小鼠和第二小鼠的腹腔注射M2丙酮酸激酶抗原100μg进行加强免疫。本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，单克隆抗体生成过程中，腹水的制备是分别在第一小鼠和第二小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂，使杂交瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长；大约1～2周后，将2×106个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔内制得。本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，所述强阳性杂交瘤细胞为阳性率达到100％的杂交瘤细胞。本专利技术的另一方面设计到一种试剂盒，包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照和缓冲液，所述捕获抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于，包括步骤：A：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程小鼠免疫：以基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1×106以上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组合液，产生抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得一株M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株；单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株制备腹水获得单克隆抗体33.26，在第二小鼠体内接种M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株制备腹水获得得到单克隆抗体31.3；B：量子点荧光探针的制备过程对QD 605溶液进行量子点活化；经过量子点活化的QD 605的溶液与抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体通过非共价偶联形成量子点荧光探针；C：往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞的荧光图像或者通过计算机分析荧光图像以判断结果。...

【技术特征摘要】
1.一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于，包括
步骤：
A：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程
小鼠免疫：以基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完
全佐剂对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；
杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1×106以上的小鼠，无菌取小鼠脾
脏制成细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二
醇溶液加入所述组合液，产生抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细
胞并选取强阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得一株M2丙酮酸激酶33.26的杂
交瘤细胞株和一株M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株；
单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细
胞株制备腹水获得单克隆抗体33.26，在第二小鼠体内接种M2丙酮酸激酶31.1
的杂交瘤细胞株制备腹水获得得到单克隆抗体31.3；
B：量子点荧光探针的制备过程
对QD605溶液进行量子点活化；
经过量子点活化的QD605的溶液与抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体
通过非共价偶联形成量子点荧光探针；
C：往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察
结直肠癌细胞的荧光图像或者通过计算机分析荧光图像以判断结果。
2.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其
特征在于：所述基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白由携带M2丙酮酸激酶蛋白基
因的大肠杆菌的工程菌株制配制而得。
3.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其
特征在于：小鼠免疫过程中，所述第一小鼠和第二小鼠为4-6周...

【专利技术属性】
技术研发人员：何凤屏，
申请(专利权)人：深圳市森塔医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44