一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒及方法，属于食品检测领域，特别涉及利用BSA与OA合成偶联物OA‑BSA，以及HRP标记OA的单克隆抗体形成HRP‑MAb。本发明专利技术的试剂盒包括OA‑BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP‑MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。本发明专利技术方法的检测限为0.19ng/ml，检测范围为0.2‑5ng/ml，换算成贝肉中的检测限为9.5ug/kg，检测范围为10‑250ug/kg，而进出口标准规定贝类总OA含量不超过160ug/kg，该试剂盒很好的达到了检测要求，同时检测限远低于基于PP2A的试剂盒(50ug/kg)和小鼠生物法(200ug/kg)。另外，本发明专利技术试剂盒价格低廉，操作简单，反应时间短，能同时检测84个样品，适用于现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒及方法。
技术介绍
大田软海绵酸(OA)是由鳍藻和原甲藻产生的一种脂溶性的海洋生物毒素。不同种类贝类通过食用海洋藻类实现了生物毒素在贝类中的富集，但贝类本身并不受该毒素影响，而人类在食用受污染的贝类后，会引起腹泻性贝类中毒(DSP)和胃肠道紊乱。通过动物实验，OA已经被证明了具有致癌性，致突变和免疫毒性。欧盟委员会(EC)规定贝肉中的最大浓度不超过160ug/kg。小鼠生物法曾被作为测定OA的标准方法。但其选择性和精度较低且涉及到伦理问题，于2011年1月已被禁止。高效液相及高效液相色谱-质谱联用的方法灵敏度高、结果准确，但设备非常昂贵、耗时、也需要熟练的操作人员，且对样品前处理有较高要求。其他技术如细胞传感器等也被用于贝类毒素的检测，但也不利于实现现场快速检测。因此迫切需要高度敏感的方法来实现快速检测贝肉中的OA毒素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，利用酶联免疫的方法，提出一种现场快速检测大田软海绵酸的试剂盒，该试剂盒具有高通量，低检测限，操作简便，耗时短，成本低的优点，填补了国内该技术的空白。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，包括OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP-MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。进一步,OA-BSA的制备过程为：(1)50μg的OA粉剂溶解在50μl甲醇溶液中，得到OA溶液。(2)将10ul20mg/ml的EDC和10ul10mg/ml的NHS加到OA溶液中，缓慢震荡2小时，得到活化的OA溶液，其中，EDC和NHS的溶剂是0.1MMES，pH＝5.5。(3)将400μl1mg/ml的BSA溶解在0.01MpH＝7.2的PBS缓冲液中，逐滴加入活化的OA溶液中。(4)以上混合液在震荡条件下持续反应4小时，得到OA-BSA溶液，同时将透析袋MW＝10000放在体积分数20％乙醇中煮沸后冷却。(5)将上述OA-BSA溶液用透析袋透析，透析液为0.01MpH＝7.2的PBS缓冲液，透析液每8小时更换一次，共更换四次，得到OA-BSA原液。进一步,OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板的制备过程为：(1)包被酶标板，孵育，洗板；包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，1L碳酸盐缓冲液中含有1.59gNaCO3、2.93gNaHCO3和0.1MNaCl；(2)封闭酶标板，孵育，洗板；封闭液为质量分数1％的BSA溶液。进一步,酶标板的孵育温度为35℃，孵育时间为1h。进一步,10×浓缩洗涤液为0.1M的PBS+1％Tween20，使用时稀释10倍。进一步,标准品浓度为0、0.2、0.5、1、2、5ng/ml。一种检测大田软海绵酸毒素的方法，包括以下步骤：(1)分别将标准品和样品加入OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板孔中，向每个孔中加入HRP-MAb，孵育，洗板；(2)加显色底物TMB，孵育；(3)加终止液HCl，在450nm处测定吸光度；(4)根据标准品的吸光度绘制检测OA毒素的标准曲线，根据标准曲线计算样品中毒素的浓度。进一步,加入酶标板孔中的样品的前处理过程为：取0.2g搅碎贝肉加1ml体积分数90％甲醇，涡旋震荡5min，7000rpm离心3min，取上清液过滤，过滤器为0.25um有机系，稀释10倍待检测。进一步,OA-BSA100ul，封闭液200ul，标准品和样品分别100ul，HRP-MAb50ul，TMB100ul，HCl100ul。进一步,步骤(1)中的孵育时间30min，步骤(2)中的孵育时间15min。本专利技术与现有技术相比的有益效果是：本专利技术技术方案相对小鼠生物法、高效液相或者高效液相色谱-质谱联用的方法、细胞传感器的方法，操作更为简单，不需要专业的操作人员和操作环境，成本更为低廉，反应更为迅速。该试剂盒的检测限为0.19ng/ml，低于基于其他原理检测OA的试剂盒。在90分钟内即可完成检测，同时具有高通量的特点，一次能检测84个样本，非常适用于现场的快速检测，且填补了国内该领域的空白。附图说明图1是所述试剂盒的原理图；图2是所述试剂盒检测大田软海绵酸浓度范围的S型曲线图；图3是所述试剂盒检测大田软海绵酸的标准曲线图；图4是所述试剂盒的特异性曲线图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细描述，但并不是限制本专利技术。实施例1：一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，具体包括OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP-MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。实施例2：抗原包被板的制备(1)抗原包被酶标板将0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，向酶标板中每孔加入100ul，35℃孵育1h。(2)洗板倒掉酶标板中的液体，向每孔中加入200ul稀释10倍的浓缩洗涤液，震荡2min，重复以上步骤3次。(3)封闭向酶标板中每孔加入1％的BSA溶液，35℃孵育1h。(4)洗板，封装按(2)中的步骤洗板，然后将抗原包被的酶标板装入铝箔袋中，放入干燥剂，真空封口机进行抽真空封口，4℃储存。实施例3：检测范围的确定向试剂盒中加入100ulOA系列浓度，0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/ml，每种浓度3个重复孔，加入HRP-MAb，孵育后洗板，然后加入TMB，孵育后加入HCl，450nm处测吸光度值，将每孔吸光度值A与浓度为0的孔的吸光度均值A0进行比较，得出A/A0。图2为随着OA浓度变化的A/A0值，由图可见，在OA浓度范围为0.2-5ng/ml范围内，A/A0与OA浓度呈现良好线性关系，图3为将该范围内的5个点选出来作标准曲线，得到r2为0.9839，呈现良好的线性关系，因此该试剂盒的线性范围确定为0.2-5ng/ml。实施例4：试剂盒的特异性向试剂盒中加入不同种类的毒素如鳍藻毒素(DTX)、石房蛤毒素(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，其特征在于，包括OA‑BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP‑MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。

【技术特征摘要】
1.一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，其特征在于，
包括OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、
HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP-MAb、10×浓缩洗涤液、
显色底物TMB、终止液HCl。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，OA-BSA的制备过
程为：
(1)50μg的OA粉剂溶解在50μl甲醇溶液中，得到OA溶液。
(2)将10ul20mg/ml的EDC和10ul10mg/ml的NHS加到OA溶液
中，缓慢震荡2小时，得到活化的OA溶液，其中，EDC和NHS的
溶剂是0.1MMES，pH＝5.5。
(3)将400μl1mg/ml的BSA溶解在0.01MpH＝7.2的PBS缓冲液
中，逐滴加入活化的OA溶液中。
(4)以上混合液在震荡条件下持续反应4小时，得到OA-BSA溶液，
同时将透析袋MW＝10000放在体积分数20％乙醇中煮沸后冷却。
(5)将上述OA-BSA溶液用透析袋透析，透析液为0.01MpH＝7.2的
PBS缓冲液，透析液每8小时更换一次，共更换四次，得到OA-BSA
原液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，OA-BSA标记的可
拆卸8*12的酶标板的制备过程为：
(1)包被酶标板，孵育，洗板；包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸
盐缓冲液，1L碳酸盐缓冲液中含有1.59gNaCO3、2.93gNaHCO3和
0.1MNaCl；
(2)封闭酶标板，孵育，洗板；封...

【专利技术属性】
技术研发人员：王平，邱先鑫，苏凯麒，钟隆洁，方佳如，田玉兰，邹瞿超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33