抗桔霉素单抗的制备方法、桔霉素试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开一种抗桔霉素单抗的制备方法、桔霉素ELISA检测试剂盒及其检测方法。抗桔霉素单抗的制备首先合成桔霉素完全抗原，然后以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗。本发明专利技术提供抗桔霉素单抗的制备方法具有制备条件温和、操作简单、过程可控等优点，提供的桔霉素ELISA检测试剂盒灵敏度为5ng/ml，具有广泛的应用前景。

Preparation method of citrinin monoclonal antibody, citrinin reagent kit and detection method thereof

The invention discloses a method for preparing monoclonal antibody against citrinin, an citrinin ELISA detection kit and a detection method thereof. The anti citrinin monoclonal antibody preparation, synthesis of citrinin antigen, and then to the citrinin antigen as an immunogen to immunize animal, using hybridoma technology for cell fusion and screening of hybridoma cell lines stably secreting anti citrinin monoclonal antibody, preparation of ascites and purified by for obtaining the anti citrinin monoclonal antibody. The invention provides a preparation method of anti citrinin monoclonal antibody has the advantages of mild preparation conditions, simple operation, controllable process, provide the citrinin ELISA kit for detecting sensitivity of 5ng/ml has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
抗桔霉素单抗的制备方法、桔霉素试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及属于生物检测
，尤其涉及抗桔霉素单抗的制备方法、桔霉素ELISA检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
桔霉素(CITRININ，CIT)，也称为桔青霉素，是一种真菌产生的有毒次级代谢产物，分子式是C13H14O5，化学结构是(3R，4S)-4，6二氢-8羟基-3，4，5-三甲基-6-氧-3H-2-苯吡-7-羧酸，相对分子为250.3Da。桔霉素是由青霉、曲霉、红曲霉等丝状真菌产生的毒素，具有严重肝肾毒性以及致畸、致癌和致突变作用。近年来的调查研究发现，许多食品和农产品中都可检测到桔霉素，主要原因是与玉米、大米、面包、奶酷、苹果、梨等农产品或食品的霉变有关。因此，桔霉素引起的食品安全问题越来越受到人们的关注。红曲霉菌在我国的应用源远流长，用红曲菌发酵可生产多种中国传统食品，如红曲洒、红腐乳、红曲米等。桔霉素是真菌的次级代谢产物，常伴随在红曲色素中产生，在大部分红曲发酵产品中，桔霉素含量最高达欧盟标准的几十到几百倍。出于食品安全的考虑，桔霉素已被欧洲各国列为必检毒素之一。目前，检测桔霉素(CIT)的方法有胶体金试纸条检测法、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、紫外分光光度法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱法等。这些方法都涉及到桔霉素抗原和桔霉素抗体两大核心免疫试剂。由于桔霉素(CIT)属于小分物质(分子量为250Da)，只具有抗原性，而无免疫原性。因此，必需将桔霉素(CIT)与载体蛋白偶联后制成完全抗原再通过免疫动物来制备抗体。ELISA法采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。ELISA法由于具有比较高的检测灵敏度、特异性，对样品要求较低，处理简单，适合于对批量样品进行检测以及推广应用，具有广大的实用价值空间，近年来被广泛应用于各种真菌毒素的临床检测当中。目前国内尚无商品化的桔霉素ELISA检测试剂盒，仅有能用于定性检测的桔霉素检测试纸(CN1603823A)，其主要原因是无法制备高亲和力和高特异性的抗桔霉素抗体，因此通过制备高亲和力和高特异性的抗桔霉素抗体来制备桔霉素ELISA检测试剂盒具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供的桔霉素单抗的制备方法具有制备条件温和、操作简单和过程可控的优点，提供的桔霉素ELISA检测试剂盒具有特异性高、灵敏度高和稳定性能好的优点。一种抗桔霉素单抗的制备方法，该制备方法包括：合成桔霉素完全抗原，其中，所述桔霉素完全抗原根据如下方法制备：桔霉素先与偶联试剂2,2-二氯-5-(2-苯乙基)-4-(三甲基硅)-3-呋喃酮和N-羟基琥珀酰亚胺反应，然后与大分子载体进行偶联，偶联反应后透析直至透析液中蛋白含量测定值与空白透析液相同，去除没有结合的桔霉素，透析物浓缩后得到桔霉素完全抗原；以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗。在本专利技术提供的抗桔霉素单抗的制备方法一较佳实施例中，合成桔霉素完全抗原的具体方法为：(1)桔霉素的活化：将13～17mg桔霉素与13～17mg的2,2-二氯-5-2-苯乙基-4-三甲基硅-3-呋喃酮以及5～7mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2ml的无水四氢呋喃中缓慢滴加10.1mol/L的HCl100μl，室温下，摇匀后再离心取上清液，用无水四氢呋喃洗涤；(2)桔霉素-载体偶联反应：待四氢呋喃吹干后，将残留物溶于0.5ml二甲基甲酰胺，然后将此溶液滴加于0.5ml5％的大分子载体溶液中并将溶液pH值调节至8.0，37℃恒温箱中缓慢摇匀60min；(3)分离纯化：偶联反应后，置于0.1mol/LNaHCO3溶液中透析，先透析1小时，再按前3次换液时间间隔为1.5小时，中间三次换液时间间隔为4.5小时，后三次换液时间为18小时的方式进行透析，使透析液中蛋白含量测定值与空白透析液相同，然后去除没有结合的桔霉素，透析物浓缩后得到桔霉素完全抗原，冻干-20℃保存。在本专利技术提供的抗桔霉素单抗的制备方法一较佳实施例中，所述大分子载体为牛血清蛋白、卵清蛋白、匙孔贝血蓝蛋白或牛甲状腺球蛋白。在本专利技术提供的抗桔霉素单抗的制备方法一较佳实施例中，以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗，具体包括如下步骤：步骤一、动物免疫：以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原以及弗氏佐剂对BALB/c小鼠进行多次免疫直至其效价检测达到1:10W；步骤二、细胞融合：取免疫小鼠的脾脏细胞，以体积比为50％的PEG1450作融合剂，按10：1细胞数量与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，融合后的细胞先用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基培养，14天后改用DMEM培养基培养；步骤三、阳性杂交瘤细胞株的亚克隆：采用桔霉素完全抗原包被的96孔酶标板检测融合后的细胞，所述96孔酶标板的包被浓度为200ng/ml，融合后的细胞加入量为100μl/孔，当检测到阳性细胞再进行亚克隆直到达到100％的阳性率；步骤四、抗体的制备和纯化(1)抗体的制备：提前7-10天，对每只致敏的BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml的液体石蜡，然后将步骤三已建的阳性杂交瘤细胞接种至已注射液体石蜡的BALB/c小鼠，7～10天后采集腹水并离心得上清液；(2)抗体的纯化：将所述上清液按1:10的比例稀释于PBS溶液中，并以0.5ml/min的速度逐量从柱上方添加于经PBS平衡的层析柱中，然后用PBS溶液洗杂，再用pH2.9的甘氨酸缓冲液洗脱，获得纯化的抗桔霉素单抗。在本专利技术提供的抗桔霉素单抗的制备方法一较佳实施例中，步骤一的动物免疫方法具体为：首次免疫，50μg/只的免疫抗原加等体积完全弗氏佐剂，皮下注射；2周后，第二次免疫，用50μg/只的免疫抗原加等体积不完全弗氏佐剂，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25μg/只的免疫抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射；7-10天后，ELISA检测免疫鼠血清效价，其效价达到1:10W即可准备做细胞融合；细胞融合前3天，再用25μg抗原腹腔注射以加强免疫。本专利技术同时提供一种桔霉素ELISA检测试剂盒，包括采用上文所述的抗桔霉素单抗的制备方法制备的抗桔霉素单抗。在本专利技术提供的桔霉素ELISA检测试剂盒一较佳实施例中，还包括桔霉素完全抗原包被的96孔酶标板、桔霉素标准品、酶标记的羊抗鼠抗体、包被液、稀释液、封闭液、显色液及终止液；其中，所述桔霉素标准品的浓度分别为0、5、10、20、40和80ng/ml；所述酶标记的羊抗鼠抗体为用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体；所述包被液为0.01mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液，用于将96孔酶标板包被的抗原稀释至200ng/ml；所述稀释液为0.01mol/LpH7.4的PBS溶液；所述封闭液为含5％小牛血清的PBS/T20；所述显色液为TMB单组分显色液；所述终止液为2mol/L的H2SO4。在本专利技术提供的桔霉素ELISA检测试剂盒一较佳实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗桔霉素单抗的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：合成桔霉素完全抗原，其中，所述桔霉素完全抗原根据如下方法制备：桔霉素先与偶联试剂2,2‑二氯‑5‑(2‑苯乙基)‑4‑(三甲基硅)‑3‑呋喃酮和N‑羟基琥珀酰亚胺反应，然后与大分子载体进行偶联，偶联反应后透析直至透析液中蛋白含量测定值与空白透析液相同，去除没有结合的桔霉素，透析物浓缩后得到桔霉素完全抗原；以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗。

【技术特征摘要】
1.一种抗桔霉素单抗的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：合成桔霉素完全抗原，其中，所述桔霉素完全抗原根据如下方法制备：桔霉素先与偶联试剂2,2-二氯-5-(2-苯乙基)-4-(三甲基硅)-3-呋喃酮和N-羟基琥珀酰亚胺反应，然后与大分子载体进行偶联，偶联反应后透析直至透析液中蛋白含量测定值与空白透析液相同，去除没有结合的桔霉素，透析物浓缩后得到桔霉素完全抗原；以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗。2.根据权利要求1所述的抗桔霉素单抗的制备方法，其特征在于，合成桔霉素完全抗原的具体方法为：(1)桔霉素的活化：将13～17mg桔霉素与13～17mg的2,2-二氯-5-2-苯乙基-4-三甲基硅-3-呋喃酮以及5～7mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2ml的无水四氢呋喃中缓慢滴加10.1mol/L的HCl100μl，室温下，摇匀后再离心取上清液，用无水四氢呋喃洗涤；(2)桔霉素-载体偶联反应：待四氢呋喃吹干后，将残留物溶于0.5ml二甲基甲酰胺，然后将此溶液滴加于0.5ml5％的大分子载体溶液中并将溶液pH值调节至8.0，37℃恒温箱中缓慢摇匀60min；(3)分离纯化：偶联反应后，置于0.1mol/LNaHCO3溶液中透析，先透析1小时，再按前3次换液时间间隔为1.5小时，中间三次换液时间间隔为4.5小时，后三次换液时间为18小时的方式进行透析，使透析液中蛋白含量测定值与空白透析液相同，然后去除没有结合的桔霉素，透析物浓缩后得到桔霉素完全抗原，冻干-20℃保存。3.根据权利要求2所述的抗桔霉素单抗的制备方法，其特征在于，所述大分子载体为牛血清蛋白、卵清蛋白、匙孔贝血蓝蛋白或牛甲状腺球蛋白。4.根据权利要求1所述的抗桔霉素单抗的制备方法，其特征在于，以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原对动物进行免疫，再应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单抗的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素单抗，具体包括如下步骤：步骤一、动物免疫：以所述桔霉素完全抗原作为免疫抗原以及弗氏佐剂对BALB/c小鼠进行多次免疫直至其效价检测达到1:10W；步骤二、细胞融合：取免疫小鼠的脾脏细胞，以体积比为50％的PEG1450作融合剂，按10：1细胞数量与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，融合后的细胞先用HAT培养基作选择性培养，7天后改用HT培养基培养，14天后改用DMEM培养基培养；步骤三、阳性杂交瘤细胞株的亚克隆：采用桔霉素完全抗原包被的96孔酶标板检测融合后的细胞，所述96孔酶标板的包被浓度为200ng/ml，融合后的细胞加入量为100μl/孔，当检测到阳性细胞再进行亚克隆直到达到100％的阳性率；步骤四、抗体的制备和纯化(1)抗体的制备：提前7～10天，对每只致敏的BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml的液体石蜡，然后将步骤三已建的阳性杂交瘤细胞接种至已注射液体石蜡的BALB/c小鼠，7～10天后采集腹水并离心得上清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，闫俊杰，裴世春，刘文婷，高建伟，
申请(专利权)人：普菲特益斯生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11