一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法，包括：S1，荧光微球标记物制备；S2,结合垫的制备；S3,硝酸纤维素膜的制备；S4,样品垫的制备；S5,检测卡组装。本发明专利技术通过在荧光微球上标记羊抗鼠IgG，然后再结合鼠抗25羟基维生素D单克隆抗体，相比在荧光微球上直接标记鼠抗25羟基维生素D单克隆抗体灵敏度更高，生产成本更低；本发明专利技术质控线上包被兔抗鸡IgY，相比哺乳动物IgG具有更低的交叉反应性和更高的特异性，使检测非特异性结合得到改善；本发明专利技术制备的高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂灵敏度达到1ng/ml，并且同时具备生产成本低、特异性强，适合基层医疗机构使用的优点。

A time resolved fluoroimmunochromatography reagent for the detection of 25 hydroxyvitamin D with high sensitivity and its preparation method

The invention relates to a method for preparing high sensitive detection of 25 hydroxy vitamin D time-resolved fluorescence immunochromatographic kit includes: S1, fluorescent microsphere preparation of markers; S2, combination pad preparation; S3, nitrocellulose membrane preparation; S4, sample pad preparation; S5 detection card assembly. The labeled Goat anti mouse IgG on fluorescent microspheres, and then combined with mouse anti 25 hydroxyvitamin D monoclonal antibodies directly labeled mouse anti D monoclonal antibody 25 hydroxy vitamin higher sensitivity than in fluorescent microspheres, the production cost is lower; the control line package by Rabbit anti chicken IgY, IgG has lower compared to mammals the cross reactivity and high specificity to detect nonspecific binding has been improved; the preparation method of the high sensitive detection of 25 hydroxy vitamin D time-resolved fluorescence immunochromatographic assay sensitivity to 1ng/ml, and at the same time with low production cost, strong specificity, suitable for use in primary medical institutions.

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂及其制备方法
本专利技术涉及生物检测
，具体地说，涉及一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂及其制备方法。
技术介绍
维生素D为一类脂溶性类固醇衍生物，分为维生素D2和维生素D3，在人体中，维生素D主要来源于阳光照射皮肤后合成，少部分从食物中摄入。合成的维生素D通过与维生素D结合蛋白结合而运输到肝脏，而摄入的维生素D通过与脂蛋白结合转运到肝脏。在肝脏内转化成25-羟基维生素D。维生素D缺乏在世界范围内普遍存在，影响着30％～50％的人口。25-羟基维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标。目前在国内市场上，已有的25-羟基维生素D检测方法主要有酶联免疫法和化学发光法，酶联免疫法和化学发光法检测25-羟基维生素D虽然线性范围宽，灵敏度高，但反应时间长，检测成本高，对检测人员要求高，这些原因导致其在基层医院难以推广。普通荧光免疫层析法克服了以上困难，仍存在灵敏度低，成本高，不能满足准确检测的要求，因此，开发一种生产成本低、灵敏度高、特异性强，适合基层医疗机构使用的检测试剂盒具有重要意义。
技术实现思路
本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法，其特征在于，包括：S1，荧光微球标记物制备：将鸡IgY加入荧光微球中混合反应，形成荧光微球和鸡IgY偶联的标记物；在荧光微球中加入羊抗鼠IgG混合反应后，再加入鼠抗25羟基维生素D，形成荧光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羟基维生素D的复合物偶联的标记物；S2,结合垫的制备：将荧光微球和鸡IgY偶联的标记物与荧光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羟基维生素D的复合物偶联的标记物混合得到混合荧光胶乳微粒，混合荧光胶乳微粒用微球稀释液稀释后喷涂在玻璃纤维上，干燥后形成结合垫；S3,硝酸纤维素膜的制备：将25羟基维生素D‑BSA蛋白复合物...

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法，其特征在于，包括：S1，荧光微球标记物制备：将鸡IgY加入荧光微球中混合反应，形成荧光微球和鸡IgY偶联的标记物；在荧光微球中加入羊抗鼠IgG混合反应后，再加入鼠抗25羟基维生素D，形成荧光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羟基维生素D的复合物偶联的标记物；S2,结合垫的制备：将荧光微球和鸡IgY偶联的标记物与荧光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羟基维生素D的复合物偶联的标记物混合得到混合荧光胶乳微粒，混合荧光胶乳微粒用微球稀释液稀释后喷涂在玻璃纤维上，干燥后形成结合垫；S3,硝酸纤维素膜的制备：将25羟基维生素D-BSA蛋白复合物用KPBS缓冲液稀释并在在硝酸纤维素膜上划线，干燥，制得检测线；将兔抗鸡IgY用KPBS缓冲液稀释并在硝酸纤维素膜上划线，干燥，制得质控线；S4,样品垫的制备：将玻璃纤维浸泡入样品垫处理液中，待玻璃纤维完全浸透，取出后干燥；S5,检测卡组装：将结合垫、吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜和底板分别裁切至预设大小，在底板上依次黏贴裁切好的硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫和样品垫，得到检测卡。2.根据权利要求1所述的高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述荧光微球为经EDC/NHS活化的荧光微球；所述荧光微球与鸡IgY的质量比为10：1～2；所述荧光微球与羊抗鼠IgG的质量比为10：1～2；所述荧光微球与鼠抗25羟基维生素D的质量比为20：0.5～1。3.根据权利要求1所述的高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，荧光微球和鸡IgY偶联的标记物与荧光微球、羊抗鼠IgG和鼠抗25羟基维生素D的复合物偶联的标记物的质量比为1:3～5；所述微球稀释液的稀释倍数为80～100倍；所述干燥温度为37℃，干燥时间为3小时。4.根据权利要求1所述的高灵敏检测25羟基维生素D的时间分辨荧光免疫层析检测试剂的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏照征，
申请(专利权)人：普菲特益斯生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11