本发明专利技术提供了一种血清或血浆中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样本前处理：往离心管内加入内标溶液10μl和人血清200μl，混合均匀，然后加600μl丙酮，混合均匀，低温静置15分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分钟；取上清液于第二离心管中，50℃氮气吹干后加入200μl乙腈复溶，混合均匀后置于离心机上，以13000rpm转速离心2‑4分钟，取上清液；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式。本发明专利技术通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及25-羟基维生素D检测的
，特别涉及一种改良的液相色谱串联质谱法检测25-羟基维生素D。
技术介绍
近十年来，大量研究显示维生素D在健康和疾病中发挥重要作用(Holick MF.Deficiency of sunlight and vitamin D.BMJ 2008；336:1318–9.Holick MF,Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health consequences.Am J Clin Nutr 2008；87:1080S–6S.)。维生素D不仅与佝偻病、骨质疏松等密切相关，与癌症、高血压、糖尿病、多发性硬化症、抑郁等也存在关系(Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med2007；357:266–81.)。研究显示幼年时期维生素D水平与童年晚期或者成年时期的许多紊乱疾病存在联系(McGrath J.Does‘imprinting’with low prenatal vitamin D contribute to the risk of various adult disorders？Med Hypotheses 2001；56:367–71.)，例如研究显示，胎儿期低维生素D水平不仅与新生儿股骨长度有关(Morley R,Carlin JB,Pasco JA,Wark JD.Maternal25-hydroxyvitamin D and parathyroid hormone concentrations and offspring birth size.J Clin Endocrinol Metab 2006；91:906–12.)，还会在9岁时降低骨密度(Javaid MK,Crozier SR,Harvey NC,et al.Maternal vitamin D status during pregnancy and childhood bone mass at age 9years:a longitudinal study.Lancet 2006；367:36–43.)。鉴于维生素D水平与健康息息相关，其水平的评估也越来越引起关注。25-羟基维生素D是维生素D的稳定代谢物，能够准确评估维生素D的水平。传统的维生素D检测方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉反应，定量不准确。有文献报道维生素D2和D3这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差异(Armas etc,(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)，而传统的免疫方法不能区分维生素D2和D3。现在越来越多的维生素D检测采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法，该方面可以同时定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，评估体内维生素D2和D3的水平(Asuka Mochizukl,Yoshio Kodera,Tatsuya Saito,et al.Preanalytical evaluation of serum25-hydroxyvitamin D3and 25-hydroxyvitamin D2measurements using LC–MS/MS.Clinica Chimica Acta 420(2013)114–120)，并且方法专属性和灵敏度性高。传统的25羟基维生素D检测方法有放射免疫法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等，但是主要存在如下问题：第一、由于25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的基质干扰。而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰；第二，现有检测技术，前处理复杂、分析时间长，方法特异性差；第三，不能同时准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，无法给出准确的25-羟基维生素D的含量；第四，整个检测过程时间长、通量低。本专利技术对25-羟基维生素D检测方法进行改良，前处理更加简单、方便，仅仅需要一步溶剂处理过程，达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有25-羟基维生素D检测方法技术中存在的部分问题，提供一种血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样本前处理：往离心管内加入内标溶液10μl和人血清200μl，混合均匀，然后加400-800μl丙酮，混合均匀，低温静置15-25分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分钟；取上清液于第二离心管中，氮气吹干后加入200μl乙腈复溶，混合均匀后置于离心机上，以13000rpm转速离心2-4分钟，取上清液；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：色谱柱：4.6×30mm，3.5μm；初始流动相的流速1ml/min，柱温30℃，检测时间6min，进样量50μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数所述流动相A为体积比0.05％甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇；25-羟基维生素D3的保留时间为3.3min；25-羟基维生素D2的保留时间为3.5min；所述多反应监测MRM质谱相关参数见表2，表2为质谱参数优选地，所述步骤(1)中低温为-20℃。优选地，所述步骤(1)中混合均匀是在涡旋仪上混合40-60秒。优选地，所述步骤(1)中第二离心管通过50℃氮气吹干。优选地，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD2：413.4→395.2；25-OHD3：401.3→383.6；d6-25-OHD3：407.5→398.5，离子源位置为2；气帘气(CUR)为30，碰撞气(CAD)为6，离子喷雾电压(IS)为5000V，温度为300℃，离子源气流(GS1)为60。优选地，所述步骤(2)中初始甲酸水溶液与甲醇的体积比为20:80。优选地，所述步骤(1)中丙酮为分析纯，含量为100％；乙腈为色谱纯，含量为100％。本专利技术的另一方面通过以下方案实现：血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下溶液：(1)洗脱液：洗脱液A：0.05％甲酸水溶液；洗脱液B：甲醇，纯度为100％；(2)标准品母液：含25羟基维生素D2，25羟基维生素D3；(3)内标溶液：含有d6-25羟基维生素D3的甲醇溶液；(4)沉淀剂：丙酮，纯度为100％；(5)复溶液：乙腈，纯度为100％；(6)质控品：含有25羟基维生素D2，25羟基维生素D3的空白血清基质溶液，浓度分别为QC1：8ng/ml；QC2：20ng/ml；QC3：40ng/ml；(7)空白血清基质：小牛血清。本专利技术的有益效果：通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理；同时APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化本文档来自技高网...
【技术保护点】
血清或血浆中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样本前处理：往离心管内加入内标溶液10μl和人血清或血浆200μl，混合均匀，然后加400‑800μl丙酮，混合均匀，低温静置15‑25分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分钟；取上清液于第二离心管中，氮气吹干后加入200μl乙腈复溶，混合均匀后置于离心机上，以13000rpm转速离心2‑4分钟，取上清液；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：色谱柱：4.6×30mm，3.5μm；初始流动相的流速为1ml/min，柱温30℃，检测时间为6min，进样量为50μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数所述流动相A为体积比为0.05％甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇；25‑羟基维生素D3的保留时间为3.3min；25‑羟基维生素D2的保留时间为3.5min；所述多反应监测MRM质谱相关参数见表2，表2为质谱参数
【技术特征摘要】
1.血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样本前处理：往离心管内加入内标溶液10μl和人血清或血浆200μl，混合均匀，然后加400-800μl丙酮，混合均匀，低温静置15-25分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分钟；取上清液于第二离心管中，氮气吹干后加入200μl乙腈复溶，混合均匀后置于离心机上，以13000rpm转速离心2-4分钟，取上清液；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：色谱柱：4.6×30mm，3.5μm；初始流动相的流速为1ml/min，柱温30℃，检测时间为6min，进样量为50μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数所述流动相A为体积比为0.05％甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇；25-羟基维生素D3的保留时间为3.3min；25-羟基维生素D2的保留时间为3.5min；所述多反应监测MRM质谱相关参数见表2，表2为质谱参数2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中低温为-20℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合均匀是在涡旋仪上混合40-60秒。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中第二离心管通过50℃氮气吹干。5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：何健，郭玉梅，宋晓涛，
申请(专利权)人：北京洛奇临床检验所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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