液相色谱串联质谱测定肉类食品中植物源性成分的方法技术

本发明专利技术提供一种基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法，包括标准植物样品的制备，高效液相色谱‑质谱联用检测以及标准植物成分特征多肽的筛选，待测肉类食品的前处理，高效液相色谱‑串联质谱检测肉类食品中的特征多肽，并与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定对应的植物源性成分。采用本发明专利技术方法可实现对特征性多肽的快速筛选以及对肉类多种植物源性成分的准确鉴别。本方法在目标蛋白筛选过程进行了优化，集中有效目标蛋白的数量，大大提高了特异性多肽的筛选速度和效率，为肉类食品中植物源性成分检出提供了一种灵敏、稳定、特异以及高通量的分析方法。

【技术实现步骤摘要】
液相色谱串联质谱测定肉类食品中植物源性成分的方法
本专利技术属于食品检测
，具体地说，涉及一种基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法。
技术介绍
随着居民生活水平的提高，对肉制品的口感及营养价值的要求也越来越高，因此肉制品的加工工艺也越来越多样化，其中加入植物蛋白是当前肉制品加工最常用的一种方式，这不仅可以改善肉制品的口感，还能够提高营养价值，更易于消化吸收。但由于植物蛋白价格低廉，因此一些不法商贩为了谋取不正当利益，添加大量的植物蛋白，或以植物蛋白替代肉进行加工，这属于以经济利益驱动的掺假(economocallymotivatedadulteration,EMA)行为，属于商业欺诈，扰乱市场秩序，严重侵犯消费者的合法权益。此外，部分敏感人群对花生、小麦等植物蛋白易产生过敏现象，进而危害生命健康。因此建立准确、高效的植物源性成分的检测方法具有重要的现实意义。蛋白质组学是以物种成分的特异性多肽作为生物标志物进行鉴别的一种方法，其中肽段是蛋白质中的一级结构，化学键更为稳定，因此在深加工肉制品检测中具有不可比拟的优势；液相色谱串联质谱具有强大的扫描功能，通过采集对应母离子二级碎裂全扫描谱图，获得更确切的定性信息的功能，可以避免复杂基质的干扰，降低假阳性概率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法，包括以下步骤：S1、标准植物样品的制备；S2、高效液相色谱-质谱联用检测以及标准植物成分特征多肽的筛选；S3、待测肉类食品的前处理；S4、高效液相色谱-串联质谱检测肉类食品中的特征多肽，并与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定对应的植物源性成分。步骤S1具体如下：S11、提取标准植物样品总蛋白：称取1-5g磨碎的标准植物样品粉末，加入5-25mL提取液，超声提取30min，然后离心，取上清液；S12、还原及烷基化：取50-250μL上清液，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10-50μL，56℃振荡反应1h，然后降至室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20-100μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15-75μL，暗处反应15min；S13、酶切：向上述反应体系中加入25mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲溶液750-2000μL，然后加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入TFA调pH值小于2终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐；S14、过柱除盐：，将S13所得溶液用C18固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；S11中所述提取液为0.05mol/LTris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH8.0。S11中超声的条件为：超声功率200W，超声频率40KHz；冰水浴条件下进行；离心的条件为：4℃，12000r/min离心20min。S14中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C18固相萃取柱，将S13所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。步骤S2利用EasynLC1000液相色谱系统和QExactiveHF质谱仪检测并筛选各种标准植物样品中的特征多肽，具体如下：色谱条件：C18色谱柱2.1mm×100mm(直径×长度)，填料粒径1.9μm；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/CAN；色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据。质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；离子源温度380℃；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7。质谱数据分析：用Maxquant对各种标准植物样品进行非标记定量分析，检索NCBI数据库，设置peptides不超过4，sequencelength于140-600之间，sequencecoverage不超过40％，uniquepeptides不超过4，其他参数设置为默认，获得相对特异性多肽，即各种标准植物样品的特征多肽。步骤S3具体如下：S31、提取待测肉类食品样品总蛋白：将待测样品剪碎或分割成小块，向1-5g样品中加入5-25mL提取液，超声提取30min，然后离心，取上清液；S32、还原及烷基化：取50-250μL上清液，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10-50μL，56℃振荡反应1h，然后降至室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20-100μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15-75μL，暗处反应15min；S33、酶切：向上述反应体系中加入25mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲溶液750-2000μL，然后加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入TFA调pH值小于2终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐；S34、过柱除盐：，将S33所得溶液用C18固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；S31中所述提取液为0.05mol/LTris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH8.0。S31中超声的条件为：超声功率200W，超声频率40KHz；冰水浴条件下进行；离心的条件为：4℃，12000r/min离心20min。S34中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C18固相萃取柱，将S13所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。步骤S4采用液质联用三重串联四极杆质谱仪进行检测，具体如下：色谱条件：C18色谱柱2.1mm×100mm(直径×长度)，填料粒径1.9μm；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/CAN；色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据。质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；离子源温度380℃；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7。通过对待测样品的特征多肽进行母离子扫描以及MRM扫描，根据保留时间，多个定性离子匹配以及丰度信息，与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定待测样品中含有的植物源性成分。本专利技术所述植物包括大豆、豌豆、小麦、玉米、花生等。本专利技术还提供按上述方法获得的不同植物源性成分的特征多肽，其中大豆、花生的多肽信息见表1。表1大豆、花生的特征多肽本专利技术基于高效液相色谱-质谱联用技术建立了一种特征性多肽筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、标准植物样品的制备；S2、高效液相色谱‑质谱联用检测以及标准植物成分特征多肽的筛选；S3、待测肉类食品的前处理；S4、高效液相色谱‑串联质谱检测肉类食品中的特征多肽，并与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定对应的植物源性成分。

【技术特征摘要】
1.基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、标准植物样品的制备；S2、高效液相色谱-质谱联用检测以及标准植物成分特征多肽的筛选；S3、待测肉类食品的前处理；S4、高效液相色谱-串联质谱检测肉类食品中的特征多肽，并与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定对应的植物源性成分。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体如下：S11、提取标准植物样品总蛋白：称取1-5g磨碎的标准植物样品粉末，加入5-25mL提取液，超声提取30min，然后离心，取上清液；S12、还原及烷基化：取50-250μL上清液，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10-50μL，56℃振荡反应1h，然后降至室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20-100μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15-75μL，暗处反应15min；S13、酶切：向上述反应体系中加入25mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲溶液750-2000μL，然后加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入TFA调pH值小于2终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐；S14、过柱除盐：，将S13所得溶液用C18固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；S11中所述提取液为0.05mol/LTris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH8.0。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S11中超声的条件为：超声功率200W，超声频率40KHz；冰水浴条件下进行；离心的条件为：4℃，12000r/min离心20min。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S14中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C18固相萃取柱，将S13所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2利用EasynLC1000液相色谱系统和QExactiveHF质谱仪检测并筛选各种标准植物样品中的特征多肽，具体如下：色谱条件：C18色谱柱2.1mm×100mm，填料粒径1.9μm；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/CAN；色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据；质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；离子源温度380℃；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7；质谱数据分析：用Maxquant对各种标准植物样品进行非标记定量分析，检索NCBI数据库，设置peptides不超过4，sequencel...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莹莹，张颖颖，王守伟，赵文涛，马燕红，郭文萍，李慧晨，任南，李志刚，陈超，
申请(专利权)人：中国肉类食品综合研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11