一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法技术

一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法其属于生物化学分析检测领域。该方法采用将血浆加入同位素内标溶液，混合均匀，然后再加二硫苏糖醇（DTT）还原，再经沉淀蛋白处理，得到含硫氨基酸的上清液。采用非衍生化法进行样本预处理，方法简单，易于操作，大大简化了样品预处理工序；同位素内标降低了基质对检测的干扰，保证了同型半胱氨酸，半胱氨酸及甲硫氨酸检测的准确度。该方法采用LC‑MS/MS法对血浆中含量硫氨酸进行检测，采用多反应检测MRM扫描方式，并首次发现

【技术实现步骤摘要】
一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法
本专利技术属于生物化学分析检测领域，涉及一种检测血浆中同型半胱氨酸（Hcy）、半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）的液相色谱串联质谱方法。
技术介绍
氨基酸是一类含有氨基和羧基的有机化合物，是构成机体组织细胞的基本组成成分，也是构成蛋白质的基本单位。文献报道，人体血浆中氨基酸的改变与众多疾病的产生都存在密切的相关性。Hcy是存在于血浆中的一种氨基酸，是Met和Cys代谢过程中的一个中间产物，但其本身不参与蛋白质的合成。正常状态下，血浆中Hcy浓度为5~15μmol/L。遗传或获得性因素，使得Hcy浓度持续高于正常值高限，即称为高同型半胱氨酸血症，较早调查分析结果显示，高同型半胱氨酸血症是冠心病，卒中和深静脉血栓形成的可干预的独立危害因素[1,2],但近来前瞻性研究结果认为，高同型半胱氨酸血症仅仅是动脉硬化的伴随现象[3,4]，由于血浆同型半胱氨酸的升高与心脑血管疾病发病率呈正相关，因此对同型半胱氨酸的测定对心脑血管疾病的预防具有重要意义。正常情况下同型半胱氨酸通过两种途径转化：一是蛋氨酸循环，Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下以维生素B12为辅助因子，5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，生成Met；第二种途径是转硫途径，Hcy在胱硫醚合成酶的作用下以维生素B6为辅助因子和丝氨酸缩合成胱硫醚，再进一步生成Cys[5]。从代谢途径中可以看出Met，Cys在同型半胱氨酸的循环中起到非常重要的作用，对Cys和Met的测定能更加全面的反应氨基酸代谢的整体情况。目前的检测方法多为衍生化法，且集中在仅对同型半胱氨酸的测定，衍生化法步骤繁琐，费时费力，成本较高。本专利技术采用的高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），将色谱的高校分辨能力和质谱的特异、灵敏、多组分检测能力有机结合。LC-MS/MS技术以其强的特异性，排除物质间的相互干扰，实现了氨基酸在非衍生化条件下的测定。本专利技术同位素内标的使用，排除了基质对待测物的干扰，定量准确。MRM检测方式，发现d3-甲硫氨酸与同型半胱氨酸（136>90通道）存在交叉干扰，利用色谱梯度的洗脱条件将其基线分离，保证检测的准确性，对多个待测物同时测定专属，准确，灵敏，高效。[1]Walds,LawM,MorrisJK.Homocysteineandcardiovasculardisease:evidenceoncausalityfromametanalysis.BMJ,2002,325(7374):1202-1206[2]Homocysteinestudiescollaboration.Homocysteineandriskofischemicheartdiseaseandstroke:ametanalysis.JAMA,2002,288(16):2015-2022[3]LoscalzoJ.Homocysteinetrials-clearoutcomesforcomplexreasonsNEnglJMed,2006,354(15):1629-1632[4]HankeyGJ.Isplasmahomocysteineamodifiableriskfactorforstroke.NatClinPractNeurol,2006,2(1):26-33[5]WelchGN,LoscalzoJ.Homocysteineandatherothrombosis.NEnglJMed,1998,338(15):1042-1050。
技术实现思路
本专利技术提供了一种非衍生化法检测同型半胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸的液质联用方法，该方法先采用二硫苏糖醇（DTT）对结合型氨基酸进行还原，再沉淀蛋白，除去血浆中的蛋白质，得到含有Hcy、Cys和Met的上清液；采用LC-MS/MS法同时对血浆中的Hcy、Cys和Met进行定量，方法中所采用的内标为同位素内标，排除基质的干扰。其中氘代甲硫氨酸对同型半胱氨酸的测定存在交叉干扰，本方法将氘代甲硫氨酸和同型半胱氨酸实现色谱分离，保证检测的准确性。该方法专属性、结果准确、检测时间短，弥补目前多数采用蒸发光对Hcy进行定量的不足，而且能更加全面的反应同型半胱氨酸代谢的整体情况。本专利技术所采用的技术方案是：一种非衍生化法检测血浆中Hcy，Cys和Met的液相色谱串联质谱方法，检测方法步骤为：A.血浆样品的制备：取血浆样品至EP管中，加入内标溶液后，加入DTT还原，再加入沉淀剂、涡旋、离心进行沉淀蛋白处理，得到含有同型半胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸的上清液。B.利用LC-MS/MS法对上述上清液进行分析和采集。步骤中A中沉淀蛋白的具体操作为加入600μL沉淀剂，涡旋30s，14000g离心3min。步骤A中还原反应的具体操作为加入100μLDTT还原剂，涡旋30s混匀后30℃水浴反应15min。步骤中A中内标溶液为氘代同型半胱氨酸(d4-Hcy)，氘代半胱氨酸（d2-Cys）和氘代甲硫氨酸（d3-Met）的混合溶液。所述还原剂为二硫苏糖醇（DTT）。所述色谱柱采用亲水色谱柱。所述样本为血浆。所述混合内标溶液为含有d4-同型半胱氨酸、d2-半胱氨酸、d3-甲硫氨酸的溶液。所述混合内标溶液浓度为：d4-同型半胱氨酸：10μmol/Ld2-半胱氨酸：100μmol/Ld3-甲硫氨酸：20μmol/L所述沉淀剂为乙腈、水、稀盐酸/甲酸/乙酸的混合溶液，其中乙腈：水：酸体积比为100:10~30:0.001~0.01。步骤中B中液相色谱条件：色谱柱：WatersXbridge4.6×50mm，3.5μm，柱温：40℃，进样室温度：4℃，流速：0.6mL/min，进样体积：1μL，流动相A:0.1%甲酸水，流动相B:乙腈，梯度洗脱；质谱条件：离子源为ESI+，脱溶剂气流速：800L/h；脱溶剂温度：500℃；毛细管电压：3KV。1)还原剂的配置：室温条件下，5g还原剂中准确加入100mL纯化水，涡旋使其溶解。2)标准曲线（质控品）制备方法：取5μL标准工作液（质控品）于1.5mL离心管中，依次加入45μL稀释液、50μL内标液、100μL还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μL沉淀剂，涡旋振荡3min中，高速离心（14000g）3min，取100μL上清液进行串联质谱分析。3)样本的制备方法：取50μL样本溶液于1.5mL离心管中，依次加入50μL内标液、100μL还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μL沉淀剂，涡旋振荡3min中，高速离心（14000g）3min，取100μL上清液进行串联质谱分析。本专利技术的有益效果：该方法采用非衍生化法进行样本预处理，方法简单，易于操作，大大简化了样品预处理工序；同位素内标降低了基质对检测的干扰，保证了同型半胱氨酸，半胱氨酸及甲硫氨酸检测的准确度。该方法采用LC-MS/MS法对血浆中同型半胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸进行检测，采用多反应检测MRM扫描方式，并首次发现d3-甲硫氨酸与同型半胱氨酸（136>90通道）存在交叉干扰，利用液相色谱梯度的洗脱条件将其基线分离，保证检测的准确性。该方法灵敏度和专属性强、结果准确。该方法采用MRM扫描，专属性高、采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法，含硫氨基酸为同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，其特征在于，包括以下步骤：（1）血浆样品的制备取血浆样品至EP管中，加入同位素内标溶液后，加入还原剂还原，再加入沉淀剂、涡旋、离心进行沉淀蛋白处理，得到含有同型半胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸的上清液；所述同位素内标溶液为含有

【技术特征摘要】
1.一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法，含硫氨基酸为同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，其特征在于，包括以下步骤：（1）血浆样品的制备取血浆样品至EP管中，加入同位素内标溶液后，加入还原剂还原，再加入沉淀剂、涡旋、离心进行沉淀蛋白处理，得到含有同型半胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸的上清液；所述同位素内标溶液为含有d4-同型半胱氨酸、d2-半胱氨酸、d3-甲硫氨酸的溶液，还原剂为二硫苏糖醇，沉淀剂为乙腈：水：酸体积比为100:10~30:0.001~0.01的混合溶液，酸为稀盐酸、甲酸或乙酸；（2）标准曲线的制备分别以同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的浓度为横坐标，以同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线；同型半胱氨酸的标准曲线为Y=0.177X﹣0.046，半胱氨酸的标准曲线为Y=0.059X﹣0.107，甲硫氨酸的标准曲线为Y=1.915X+0.118；（3）利用LC-MS/MS对上述上清液进行分析和采集取50μL样本溶液于1.5mL离心管中，依次加入50μL内标液、100μL还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15m...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹云峰，孙晓宇，刘丽杰，刘明莉，赵姝琦，孙宏治，洪沫，高鹏，房中则，
申请(专利权)人：辽宁润生康泰生物医药科技有限公司，锦州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21