一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其属于分析检测技术领域。该方法采用先加入还原剂把血浆中的半胱氨酸和同型半胱氨酸还原；再加入沉淀剂进行蛋白沉淀；然后取上清夜加入反应溶剂和衍生试剂进行氨基酸衍生化反应；最后采用色谱柱进行分离和质谱检测测定。本发明专利技术的方法能同时对血浆中的叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸一次性测定，排除其它物质的干扰。该方法精密度、准确度和灵敏度高，线性范围宽，可用于大批量血浆样本中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸含量的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其属于分析化学检测
技术背景同型半胱氨酸是体内蛋氨酸循环和半胱氨酸代谢的中间产物，并能回转成蛋氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸。人正常空腹状态下同型半胱氨酸在血浆中浓度为5-15umol/L。研究表明，同型半胱氨酸在人体中的含量升高与心脑血管疾病、外周血管疾病、神经系统退行性疾病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肝硬化、慢性肾病等疾病高度相关密切相关。近年来，大量研究报道叶酸能有效降低血浆中同型半胱氨酸的浓度。因此，检测血浆中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量对于临床医学具有重要的现实意义。目前大多数的临床实验室采用的叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的检测方法主要是酶联免疫法。酶联免疫试剂盒方法准确度相对较低、价格偏高且每次测定只能测定一种物质，其大规模的应用存在一定的局限性。我们采用液质联用法，是一种高灵敏度、高选择性和高准确度的定量测定方法，能够一次性的从数十微升血浆中同时测定叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量，为临床大规模的应用提供了必要的条件。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种用于检测血浆中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的方法，提供一种Ner试剂用于待测样本的快速处理，并建立了选择性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的同时检测血浆中4种小分子含量的方法用于血浆或血清中4种化合物的同时检测。本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，所述含硫氨基酸为半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸，该方法包括以下步骤：（1）将待测样本和Ner试剂溶液混匀，涡旋后静置10min；所述Ner试剂溶液为含内标、还原剂的有机溶剂混合提取液，所述内标为正缬氨酸，还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、巯基乙胺或者巯基乙醇；（2）高速离心后取上清液进行衍生，衍生法采用柱后衍生法，衍生试剂为6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯溶液；（3）采用色谱柱进行分离，质谱检测，并与标准曲线进行比较，测定叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量。待测样本与Ner试剂体积比为1：4。所述Ner试剂中内标的浓度为0.5-10ppm，Ner试剂中还原剂的浓度为50mmol/L-300mmol/L，Ner试剂中有机溶剂为甲醇、乙腈、丙酮、10%的三氯乙酸或者10%磺基水杨酸。进一步，所述Ner试剂中内标的浓度为2ppm，Ner试剂中还原剂为DTT，DTT的浓度为100mmol/L，Ner试剂中有机溶剂为甲醇。所述标准曲线采用经内标正缬氨酸峰面积校正后的目标化合物的峰面积与对应浓度绘制，同型半胱氨酸标准曲线为YHcy=1.15704xHcy+0.0126706，R=0.998348，其中同型半胱氨酸的浓度为0.05-50ppm；半胱氨酸标准曲线为YCys=1.5427xCys+0.081479，R=0.99115，其中半胱氨酸的浓度为0.05-50ppm；蛋氨酸标准曲线为YMet=0.253568xMet+0.00479196，R=0.999732，蛋氨酸的浓度为0.05-50ppm；叶酸标准曲线为Yfolicacid=1280.83xfolicacid+115.08，R=0.993533，叶酸浓度为0.05-50ppm。所述色谱柱为UnitaryC18,2.8um,100Å,2.1×150mm色谱柱。所述色谱柱分离所用的流动相A为含20mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液；流速为0.3mL/min，柱温45℃，色谱柱流动相条件包括：时间（min）流速（mL/min)流动相A（%）流动相B（%）00.390100.50.390103.50.3109050.32985.50.3901080.39010所述质谱检测采用串联三重四级杆质谱仪进行检测，检测条件为：电离源：电喷雾ESI源正离子模式；毛细管电压：3.0kv；离子源温度：150℃；去溶剂温度：500℃；去溶剂气流量：800L/h，锥孔气流量：150L/h；扫描方式为多反应监测离子扫描MRM，其中MRM条件包括：。该方法应用于检测离体人血浆或血清中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量。本专利技术方法采用LC-MS液质联用分析检测方法，所检测的样本为血浆或血清，优选血浆。本专利技术方法同时检测血浆中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸四种物质，包含前处理方法为：将待测样本血浆和NER试剂混合10min，高速离心后，上清液进行衍生；最后和流动相一起采用色谱柱进行分离，质谱检测，并与标准曲线进行比较，最终计算叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量。本专利技术所述的NER试剂为含2ppm正缬氨酸，100mmol/L还原剂的混合有机试剂，每个血清或血浆样品取样50uL，加入200uLNer试剂溶液，涡旋混匀后静置10min。采用的内标正缬氨酸不存在于血浆或血清中，在本实验条件下能够和其同分异构体缬氨酸在色谱上完全分离，价格经济划算，作为内标比较合适。采用的还原剂为DTT、TCEP或者巯基乙醇溶液中的一种，浓度为50mmol/L-300mmol/L，优选100mmol/LDTT溶液；试验考察了Ner试剂中的有机试剂，在本实验过程中，甲醇、乙腈、10%的三氯乙酸或者10%磺基水杨酸都可以作为有机溶剂，其中甲醇和乙腈的灵敏度及提取回收率较高。考虑到检测化合物的回收率、蛋白的沉淀效率、酸对后续检测的干扰以及沉淀剂对化合物的影响，优选的，方法中所述有机溶剂选择为甲醇。试验考察了Ner试剂溶液中还原剂，DTT、TCEP、巯基乙胺或者巯基乙醇都能将血浆中氧化态的半胱氨酸和同型半胱氨酸还原，且不对后续所有化合物进行干扰，优选的，方法中所使用的还原剂采用DTT。试验选择硼酸溶液和6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯溶液（AQC）为衍生试剂，AQC能够很好的与正缬氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸发生衍生化反应，而叶酸在衍生过程中保持不变。试验采用液相色谱柱为UnitaryC18,2.8um,100Å,2.1×150mm色谱柱，流动相条件优化后的条件为：试验采用watersTQS质谱检测器进行检测，优选的条件为：采用的MRM条件为：通过以上步骤，根据优化后的方法可以同时检测出叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸四种物质在血浆中的含量。本专利技术的有益效果为：该方法采用先加入还原剂把血浆中的半胱氨酸和同型半胱氨酸还原；再加入沉淀剂进行蛋白沉淀；然后取上清夜加入反应溶剂和衍生试剂进行氨基酸衍生化反应；最后采用色谱柱进行分离和质谱检测测定。本专利技术的方法能同时对血浆中的叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸一次性测定，排除其它物质的干扰。该方法精密度、准确度和灵敏度高，线性范围宽，可用于大批量血浆样本中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸含量的检测。1.高准确度。采用液质联用仪器进行检测，分离采用新型合成UnitaryC18,2.8um,100Å,2.1×150mm色谱柱，分离效果好，检测模式为多反应监测。选择性的对血浆样品中叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸进行检测，准确度高。有效解决了目前免疫测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于，所述含硫氨基酸为半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸，该方法包括以下步骤：（1）将待测样本和Ner试剂溶液混匀，涡旋后静置10min；所述Ner试剂溶液为含内标、还原剂的有机溶剂混合提取液，所述内标为正缬氨酸，还原剂为二硫苏糖醇、三(2‑羧乙基)膦、巯基乙胺或者巯基乙醇中的一种；（2）高速离心后取上清液进行衍生，衍生法采用柱后衍生法， 衍生试剂为6‑氨基喹啉基‑N‑羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯溶液；（3）采用色谱柱进行分离，质谱检测，并与标准曲线进行比较，测定叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于，所述含硫氨基酸为半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸，该方法包括以下步骤：（1）将待测样本和Ner试剂溶液混匀，涡旋后静置10min；所述Ner试剂溶液为含内标、还原剂的有机溶剂混合提取液，所述内标为正缬氨酸，还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、巯基乙胺或者巯基乙醇中的一种；（2）高速离心后取上清液进行衍生，衍生法采用柱后衍生法，衍生试剂为6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯溶液；（3）采用色谱柱进行分离，质谱检测，并与标准曲线进行比较，测定叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于：待测样本与Ner试剂体积比为1：4。3.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于：所述Ner试剂中内标的浓度为0.5-10ppm，Ner试剂中还原剂的浓度为50mmol/L-300mmol/L，Ner试剂中有机溶剂为甲醇、乙腈、丙酮、10%的三氯乙酸或者10%磺基水杨酸中的一种。4.根据权利要求1或3所述的一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于：所述Ner试剂中内标的浓度为2ppm，Ner试剂中还原剂为二硫苏糖醇，二硫苏糖醇的浓度为100mmol/L，Ner试剂中有机溶剂为甲醇。5.根据权利要求1或3所述的一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法，其特征在于：所述标准曲线采用经内标正缬氨酸峰面积校正后的目标化合物的峰面积与对应浓度绘制，同型半胱氨酸标准曲线为YHcy=1.15704xHcy+0.0126706，R=0.998348，其中同型半胱氨酸的浓度为0.05-50ppm；半胱氨酸标准曲...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙宏治，曹云峰，朱志图，高鹏，葛广波，房中则，董军，洪沫，孙晓宇，王天一，
申请(专利权)人：辽宁润生康泰生物医药科技有限公司，锦州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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