一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法技术

一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法，属于生物化学分析检测领域。本发明专利技术通过在血浆/尿液中加入同位素内标溶液，混合均匀后过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用离线SPE法进行样本预处理，较在线SPE法节省成本，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本发明专利技术首次应用国产C18CEX SPE填料，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中MN和NMN的超高效液相色谱串联质谱法。该预处理方法操作简单、且国产填料的应用打破市场垄断，超高效液相色谱串联质谱法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。

A super high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous detection of methoxy adrenaline and methoxy norepinephrine

A method for simultaneous detection of methoxy epinephrine and methoxy norepinephrine in plasma / urine by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry is a biochemical analytical field. By adding isotopic internal standard solution in plasma / urine, the invention is evenly mixed after 96 perforated plates activated by equilibrium, then eluted and eluted, and finally the elution solution containing methylephrine is finally collected. The off-line SPE method is used to pretreat the samples, which can save the cost compared with the online SPE method. It can not only enrich the samples effectively, but also eliminate the impurities and reduce the matrix effect. This invention is the first application of C18CEX SPE filler, a simultaneous quantitative determination of plasma MN and NMN in urine by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. The pretreatment method is simple and the application of domestic fillers breaks the market monopoly. Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has high sensitivity, specificity and accuracy. It has good clinical application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法
本专利技术属于生物化学分析检测领域，涉及一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法。
技术介绍
嗜铬细胞瘤是一种罕见的内分泌性疾病，主要发生于肾上髓质的嗜铬细胞，会引起儿茶酚胺分泌增加。由于肿瘤组织分泌大量儿茶酚胺，作用于肾上腺素能受体，嗜铬细胞瘤常以阵发性或持续性高血压和代谢紊乱为主要临床表现，其他症状包括头痛，发作性出汗，心动过速，体重下降，疲劳，直立性低血压，焦虑精神紧张和苍白，还可能伴有致死性心血管并发症。因此，进行早期诊断并合理治疗至关重要。嗜铬细胞瘤的诊断包括生化测试、影像学检测和遗传测试，生化检测是第一步也是至关重要的一步。在过去，尿液和血浆中儿茶酚胺的测定是评价嗜铬细胞瘤的主要生化方法，由于嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺是间断性分泌的，这种诊断方法并不准确。在嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺不断转化成甲氧基肾上腺素（metanephrine,MN）和甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine,NMN）两种代谢产物，MN和NMN的分泌不依赖于体内多变的儿茶酚胺。因此，血浆或尿液中MN和NMN的测定，可作为嗜铬细胞瘤生化诊断更精准的检测指标[1]。对于生物体液中甲氧肾上腺素的分析技术要求有高的灵敏度和特异性。因此，迫切需要一种操作简单、稳定且灵敏度高，特异性好的检测方法。早期的放射酶免疫法、气相色谱或荧光检测已被高灵敏度和高选择性的HPLC串联电化学或荧光检测所代替，后者在临床生化实验中被广泛接受。尽管如此，其色谱分离前期的纯化步骤仍非常重要，且不容忽视。近期报道的方法中大多应用多聚合填料的WCXSPE，本专利技术通过对SPE填料的筛选，首次应用国产C18CEXSPE对血浆/尿液进行预处理，该方法操作简单，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应，满足甲氧肾上腺素对预处理方法的要求，具有良好的临床应用前景。超高效液相色谱串联质谱法，以其极高的灵敏度和特异性，在对甲氧肾上腺素的测定中显现出相当的优势。本专利技术应用超高效液相色谱串联质谱技术首次建立一种检测血浆/尿液中甲氧肾上腺素含量的方法，该方法特异性强，灵敏，准确，高效，在临床样本检测中体现出卓越的优势。
技术实现思路
一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素（MN）和甲氧基去甲肾上腺素（NMN）的超高效液相色谱串联质谱方法，属于生物化学分析检测领域。本专利技术通过在血浆/尿液中加入同位素内标溶液，混合均匀后过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用离线SPE法进行样本预处理，较在线SPE法节省成本，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本专利技术首次应用国产C18CEXSPE填料，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中MN和NMN的超高效液相色谱串联质谱法。该预处理方法操作简单、且国产填料的应用打破市场垄断，超高效液相色谱串联质谱法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。本专利技术所采用的技术方案是：一种同时检测血浆/尿液中MN和NMN的超高效液相色谱串联质谱方法，检测方法步骤为：A.样品的制备：取样品至EP管中，加入内标溶液后，混合均匀，过活化平衡好的96孔板，再经过3次淋洗，最后洗脱，收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。B.利用HPLC-MS/MS法对上述洗脱液进行分析和采集。步骤A中淋洗的具体操作为：加入500μL纯水进行第一次淋洗，完成之后加入200μL甲醇进行第二次淋洗，最后加入200μL乙腈进行第三次淋洗。步骤A中洗脱的具体操作为：加入200μL乙腈，EP管收集洗脱液。步骤中A中内标溶液为氘代变肾上腺素(d3-MN)，氘代去甲变肾上腺素（d3-NMN）的混合溶液。所述色谱柱采用亲水色谱柱。所述样本为血浆/尿液。所述混合内标溶液浓度为：d3-变肾上腺素：30nmol/Ld3-去甲变肾上腺素：30nmol/L步骤B中液相色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLC@BEHHILIC2.1×100mm，1.7μm；柱温：40℃，进样室温度：4℃，流速：0.4mL/min，进样体积：10μL，流动相A:0.2%甲酸水溶液，流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；质谱条件为：离子源：ESI+；脱溶剂气流速：800mL/h；脱溶剂温度：500℃；毛细管电压：3KV。1)标准曲线（质控品）制备方法：取30μL标准工作液（质控品）于1.5mL离心管中，加入270μL4%BSA，涡旋15s，SPE96孔板经500μL甲醇活化，500μL纯水平衡后，上样，依次用500μL的纯水，200μL甲醇，200μL甲酸乙腈淋洗，最后用200μL乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μL至进样小瓶中，HPLC-MS/MS方法进样10μL分析。2)样本的制备方法：取300μL待测样品溶液于1.5mL离心管中，加入20μL内标液、涡旋15s，SPE96孔板经500μL甲醇活化，500μL纯水平衡后，上样，依次用500μL的纯水，200μL甲醇，200μL乙腈淋洗，最后用200μL乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μL至进样小瓶中，HPLC-MS/MS方法进样10μL分析。本专利技术的有益效果：本专利技术采用将血浆/尿液加入同位素内标溶液，混合均匀，过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用SPE法进行样本预处理，方法通量高，有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本专利技术首次应用基于C18CEXSPE填料的预处理方法，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中MN和NMN的超高效液相色谱串联质谱法，该方法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例所述的含MN和NMN混合标准品及各待测物内标溶液的MRM色谱图。图2是本专利技术实施例所述的血浆样本及内标溶液MRM色谱图。具体实施方式下面以富集效果最好的C18CEX96孔板为具体实例，进一步阐述本专利技术。该应用实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。1.仪器与试剂液相色谱-质谱联用仪：UHPLC-XevoWaters高速冷冻离心机：TECHCOMP型号CT18RT恒温混旋仪：THERMO-SHAKER型号AS20130565138超声波清洗器：新芝型号SB-25-12D甲酸（色谱级），乙腈（色谱级），水（娃哈哈纯净水）2.标准溶液的制备分别取MN、NMN的标准品适量，精密称定，置于EP管中，乙腈将其溶解，制成含MN、NMN的混合标准品溶液，备用。用乙腈稀释上述混合标准品溶液，制成如下浓度的系列标准溶液及QC溶液，见表2。表2MN、NMN的系列标准溶液及QC溶液3.色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLC@BEHHILIC2.1×100mm，1.7μm；流动相：0.2%甲酸水溶液（A），乙腈（B）；梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL4.质谱条件：离子源：ESI+源温：150℃脱溶解气温度：500℃；脱溶剂气流速：800L/h；毛细管电压：3KV；待测物MRM扫描参数见表3。表3MN、NMN及内标的MRM扫描参数5.前处理方法：5.1标准工作液/质控品前处理方法：取3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品的制备取待测样品至EP管中，加入同位素内标溶液后，96孔板经活化，平衡后上样，再经过3次淋洗，最后洗脱，收集含甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的洗脱液；所述同位素内标溶液为含有

【技术特征摘要】
1.一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品的制备取待测样品至EP管中，加入同位素内标溶液后，96孔板经活化，平衡后上样，再经过3次淋洗，最后洗脱，收集含甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的洗脱液；所述同位素内标溶液为含有d3-变肾上腺素、d3-去甲变肾上腺素，3次的淋洗液依次为：纯水、甲醇、乙腈，洗脱液为：乙腈（2）标准曲线的制备以甲氧基肾上腺素的浓度为横坐标，以甲氧基肾上腺素与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线；甲氧基肾上腺素的标准曲线为Y=0.728X﹣0.052；以甲氧基去甲肾上腺素的浓度为横坐标，以甲氧基去甲肾上腺素与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线；甲氧基去甲肾上腺素的标准曲线为Y=0.488X+0.001；（3）利用HPLC-MS/MS对上述洗脱液进行分析和采集取300μL待测样品于EP管中，加入20μL内标液，混匀待用，96孔板用500μL甲醇活化，500μL纯水平衡，上样300μL，依次用纯水，甲醇，乙腈淋洗，最后用200μL乙腈洗脱，得到含有甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的洗脱液，吸取150μL上述洗脱液进行串联质谱分析；液相色谱条件为，色谱柱：WatersACQUI...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹云峰，姜钧瀚，高鹏，孙晓宇，刘丽杰，刘明莉，洪沫，郭志谋，
申请(专利权)人：辽宁润生康泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21