一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法技术

本申请涉及一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。其中所述的23种脂肪酸分别为：C14:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3‑α、C20:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5、C22:6、C24:0、C24:1；该方法采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量。本发明专利技术方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，3min可完成23种脂肪酸的分离和检测，精密度和准确度基本满足要求。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物化学分析检测领域，涉及一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。技术背景脂肪酸(fattyacids)是一类羧酸化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。根据单双键组成脂肪酸可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸3种。它们在生命过程中互相转换，对调节生物体内各项生理和生物功能起着重要作用，主要包括：①合成磷脂构成生物膜，维护细胞和器官的生物化学特性②作为哺乳动物主要贮存能量的物质③作为第二信使的前体物质。生物样本中的脂肪酸组成及含量变化是评价机体脂肪酸摄入和能量代谢的重要标志，随着生命科学技术的发展，脂肪酸的定性、定量研究为医学基础科研和临床检验提供了重要的依据。流行病学研究表明，脂肪酸与自身免疫性疾病以及风湿性关节炎，神经退行性疾病，肾脏和肝脏等疾病的发生具有一定的关联性。人体血清中总脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行人体血液中的脂肪酸组分分析有助于健康状况评价。但由于脂肪酸生理作用的复杂性，代谢的多变性以及缺乏适当、准确的研究手段，使得脂肪酸等小分子脂类研究受到限制。目前测定血清中脂肪酸的方法较多，如酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法、气相色谱法等。以上方法操作繁琐且精密度差。目前市场上开发出一种用于检测脂肪酸的试剂盒，该试剂盒存在稳定性不好，测定范围不一致，线性范围窄等缺点。综上所述，临床上以及科研中迫切需要一种能够对脂肪酸进行快速、稳定并且灵敏度高的测定试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒，其包括：洗脱液，23种标准曲线混合工作液，基质，沉淀剂，同位素内标，稀释液，复溶液，质控品，其中上述各组分具体见下表，23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制23种标准曲线混合工作液中的STDA，STDB，STDC，STDD，STDE，STDF，STDG，STDH为：质控品中的QC(L)，QC(M)，QC(H)为：一种同时检测23种脂肪酸的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，所述的23种脂肪酸分别为：C14:0(肉豆蔻酸)、C14:1(肉豆蔻油酸)、C16:0(棕榈酸)、C16:1(棕榈油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)、C18:3-α(α-亚麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(二十碳烯酸)、C20:2(二十碳二烯酸)、C20:3(二十碳三烯酸)、C20:4(花生四烯酸)、C20:5(二十碳五烯酸)、C22:0(山嵛酸)、C22:1(芥酸)、C22:2(二十二碳二烯酸)、C22:3(二十二碳三烯酸)、C22:4(二十二碳四烯酸)、C22:5(二十二碳五烯酸)、C22:6(二十二碳六烯酸)、C24:0(木焦油酸)、C24:1(神经酸)；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量。其中预处理方法为：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。具体色谱条件为：(1)高效液相色谱条件：前柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18guardcolumn(2.1mminnerdiameter×5mmwith1.7μmparticles)；色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18column(2.1mminnerdiameter×50mmwith1.7μmparticles)；流动相A：10mmoL/L甲酸铵水溶液；流动相B：10mmoL/L甲酸铵甲醇溶液；采用梯度洗脱的方式，洗脱程序见表1；柱温：40℃；进样室温度：4℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；表1流动相梯度洗脱参数Time(min)流动相A(v％)流动相B(v％)0.0010900.501992.001992.2010903.401090(2)质谱条件在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式：喷雾电压为﹣4500V；气帘气为25psi；离子源雾化气和加热辅助器均为50psi；去溶剂温度为500℃；各个目标物的质谱参数见表2表2脂肪酸质谱参数其中，所述的血浆为人的血浆，其中，所述的经过预处理的血浆按照如下方法制备得到：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。其中所述的内标物为混合内标液，其为300μL含2nmolC16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇溶液，具体配制方法如下：精确称取1mgBHT粉末，加入100mL甲醇中，再精密量取68μL浓度为10mmol的C16D31脂肪酸氘代内标溶液。所述的标准品按表3配制成标准母液，具体标准品量和甲醇体积见表3，表323种脂肪酸标准母液配制方法分别从以上的标准母液中吸取2.5μL、2.5μL、20μL、5μL、10μL、20μL、20μL、5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、2.5μL、10μL、10μL于玻璃试管中，用甲醇定容至500μL，得到23种脂肪酸的最大终浓度(MIXH)分别为50μmoL/L、50μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、200μmoL/L、400μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L。23种脂肪酸的混合标准品溶液按表4进行配制得到如下浓度的系列标准品溶液，见表5表4各级MIX配制如表：(μL)MeOH(μL)MIXG150MIXH50MIXF100MIXH100MIXE100MIXF100MIXD100MIXE100MIXC100MIXD100MIXB80MIXC120MIXA80MIXB120表5标准品溶液进样曲线范围在该方法中使用的色谱瓶内插管为玻璃材质，在洗针液中加入异丙醇。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术采集200例健康人的血液对该方法进行反复验证，通过数据可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒，其包括：洗脱液，23种标准曲线混合工作液，基质，沉淀剂，同位素内标，稀释液，复溶液，质控品，其中上述各组分具体见下表，23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制

【技术特征摘要】
1.一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒，其包括：洗脱液，23种标准曲线混合工作液，基质，沉淀剂，同位素内标，稀释液，复溶液，质控品，其中上述各组分具体见下表，23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制23种标准曲线混合工作液中的STDA，STDB，STDC，STDD，STDE，STDF，STDG，STDH为：质控品中的QC(L)，QC(M)，QC(H)为：2.一种同时检测23种脂肪酸的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，所述的23种脂肪酸分别为：C14:0(肉豆蔻酸)、C14:1(肉豆蔻油酸)、C16:0(棕榈酸)、C16:1(棕榈油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)、C18:3-α(α-亚麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(二十碳烯酸)、C20:2(二十碳二烯酸)、C20:3(二十碳三烯酸)、C20:4(花生四烯酸)、C20:5(二十碳五烯酸)、C22:0(山嵛酸)、C22:1(芥酸)、C22:2(二十二碳二烯酸)、C22:3(二十二碳三烯酸)、C22:4(二十二碳四烯酸)、C22:5(二十二碳五烯酸)、C22:6(二十二碳六烯酸)、C24:0(木焦油酸)、C24:1(神经酸)；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量，具体色谱条件为：其中预处理方法为：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。(1)高效液相色谱条件：前柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18guardcolumn(2.1mminnerdiameter×5mmwith1.7μmparticles)；色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18column(2.1mminnerdiameter×50mmwith1.7μmparticles)；流动相A：10mmoL/L甲酸铵水溶液；流动相B：10mmoL/L甲酸铵甲醇溶液；采用梯度洗脱的方式，洗脱程序见表1；柱温：40℃；进样室温度：4℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；表1流动相梯度洗脱参数Time(min)流动相A(v％)流动相B(v％)0.0010900.501992.001992.2010903.401090(2)质谱条件在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓宇，赵福荣，曹云峰，洪沫，蒋宏峰，房中则，孙冬雪，王爽，
申请(专利权)人：辽宁润生康泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21