血浆乙醇检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开一种乙醇检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括磷酸盐缓冲液、乙醇脱氢酶(ADH)溶液、氧化型辅酶I(NAD+)溶液及丝网印刷电极。所述血浆乙醇检测试剂盒采用丝网印刷电极进行电化学检测，通过电化学分析方法间接实现血浆乙醇的快速、准确测定，是一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血浆乙醇检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗检测技术，主要涉及血浆乙醇检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
乙醇(C2H5OH)俗称酒精，是酒的主要成分。随着社会经济的高速发展，人民生活水平日益提高，饮酒成为一种普遍的社会现象，然而也带来了一系列影响深远的医学问题和社会问题。据世界卫生组织调查，全球每年饮酒人数大约20亿，造成死亡人数多达180万，酒类已成为危害人类健康的第三大危险因素。饮酒后乙醇可于30min～90min内在胃及肠道内被完全吸收入血，15min～90min内，浓度可达到峰值。其代谢主要是在肝脏内被氧化分解，少量以原形经呼吸道、尿、汗直接排出体外。一般乙醇中毒出现的症状为：兴奋，狂躁，共济失调，昏迷。长期过量饮酒不仅可以引起酒精性肝病，而且心脏疾病、急性胰腺炎、胃肠道出血等疾病发病率明显增加。近年来，饮酒人群呈现低龄化发展，因酒精导致青少年意外性伤害、猝死、性侵害的发生率不断增加。饮酒所引发的问题越来越受到社会的广泛关注。目前，血液中乙醇浓度检测的方法有：1)气相色谱法具有分离效率高、检测灵敏度高、样品用量少、选择性好、应用范围广等特点，但受限仪器设备因素难以广泛用于普通实验室。2)气相色谱-质谱(GC-MS)联用法结合了色谱定量和质谱定性的强大功能，但仪器昂贵且需专人操作，维护保养麻烦，不能普及使用。3)酶法由于酶促反应的专一性、高效性，避免试样中众多共存组分的干扰，减少繁杂的预处理过程，缩短测定时间，节省试剂的用量，并获得较高灵敏度。电化学分析方法是根据物质在溶液中的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质量之间的计量关系的基础上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。目前，国内外还没有关于电化学分析方法检测血浆乙醇的试剂盒及其使用方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术致力于提供一种试剂简单，价格低廉，使用方便的血浆乙醇检测试剂盒及其使用方法，本试剂盒采用电化学分析法对血浆乙醇进行快速准确的测定。本专利技术的血浆乙醇检测试剂盒的检测原理为：利用待测血浆样品中的乙醇在ADH酶特异性地催化下与氧化型辅酶I(NAD+)反应生成乙醛及还原性辅酶I(NADH)，NADH在丝网印刷电极表面被氧化生成NAD+，同时失去电子产生电信号；利用电化学工作站对NADH所产生的氧化峰电流进行检测，其氧化峰电流与待测血浆样品中乙醇的浓度呈正相关，从而实现对血浆乙醇的间接定量分析。一种血浆乙醇检测试剂盒，包括磷酸盐缓冲液、氧化型辅酶I(NAD+)溶液、乙醇脱氢酶(ADH)溶液及丝网印刷电极。其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag/AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。其中，更优地，所述ADH溶液的浓度为360.0U/L，所述NAD+溶液的浓度为100.0mmol/L，所述磷酸盐缓冲液为220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸盐缓冲液。其中，所述磷酸盐缓冲液由220.0mmol/L磷酸钠溶液与磷酸氢二钠溶液配制。本专利技术所述的血浆乙醇检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：1)将待测血浆样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，涡旋混匀；2)分别取步骤1)得到的溶液、所述ADH溶液、所述NAD+溶液、所述磷酸盐缓冲液于Ep管中涡旋混匀，在室温下反应12min，得到反应混合液；3)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤2)得到的所述反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。所述的血浆乙醇检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将所述待测血浆样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，涡旋混匀；2)分别取步骤1)得到的溶液、360.0U/L的ADH溶液、100.0mmol/L的NAD+溶液以及220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸盐缓冲液于Ep管中涡旋混匀，在室温下反应12min，得到反应混合液，其中所述步骤1)得到溶液，所述ADH溶液，所述NAD+溶液与所述磷酸缓冲液的体积比1∶1∶1∶20；3)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤2)得到的所述反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。所述的血浆乙醇检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1)取10μL所述待测血浆样品于Ep管中，加入990μL的所述磷酸盐缓冲液，涡旋混匀；2)分别取步骤1)得到的溶液、360.0U/L的ADH溶液、100.0mmol/L的NAD+溶液各4μL，以及220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸盐缓冲液80μL涡旋混匀，在室温下进行反应12min，得到反应混合液；3)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，将步骤2)得到的反应混合液滴加在所述电极的工作区域，对反应产物NADH的氧化峰电流进行测定，从而对所述待测血浆样品中的乙醇定量，其参数设置为：低电位0V，高电位+1.0V，电位增量0.005V、振幅0.1V、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s。本专利技术所述血浆乙醇检测试剂盒的有益效果如下：1)本专利技术所述血浆乙醇检测试剂盒使用丝网印刷电极配合电化学工作站对血浆乙醇进行测定，检测仪器操作简单，价格低廉，可移动性强。2)本专利技术使用的丝网印刷电极成本低，具有可批量制作的特点。实现了电极的一次性使用，避免了对固体电极单调沉闷的打磨抛光；另外也避免重复使用造成实验交叉污染。3)本专利技术所述的试剂盒中待测血浆样品无需去蛋白等预处理，所用试剂种类少，用量小，降低了血浆乙醇检测的成本，且可大大降低对环境的污染。4)本专利技术所述的试剂盒用于血浆乙醇的检测，检测迅速，具有良好的精密度，较高的灵敏度，准确度，可用于对血浆乙醇进行快速准确测定。附图说明图1为本专利技术丝网印刷电极结构图。图中1、工作电极，2、辅助电极，3、参比电极，4、圆形工作区域，5、PET基板。图2为血浆乙醇的示差脉冲伏安曲线图。图中实线为加标血浆示差脉冲伏安曲线，虚线为空白血浆示差脉冲伏安曲线。图3为本专利技术磷酸盐缓冲液pH值影响NADH的氧化峰电流的曲线图。图中◆代表血浆的氧化峰电流。图4为本专利技术NAD+浓度影响NADH的氧化峰电流的曲线图。图5为本专利技术ADH浓度影响NADH的氧化峰电流的曲线图。图6为本专利技术中NADH氧化峰电流对血浆乙醇浓度的标准曲线图。图7为本专利技术血浆乙醇检测结果与公安司法鉴定机构检测结果的相关性图。具体实施方式本专利技术电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例，其购自于上海辰华仪器有限公司，ADH购于Sigma-Aldrich公司(A3263-7.5ku)，NAD+(Roche10621650001)购于罗氏控股股份有限公司。实施例1：血浆乙醇检测试剂盒的制备1)配制磷酸盐缓冲液：分别配制220.0mmol/L磷酸钠与磷酸氢二钠溶液，再按一定体积比混合配制pH＝10.4磷酸盐缓冲液，置于容器中，2～8℃保存；2)配制360.0U/L的ADH溶液：将购买ADH的配制成浓度为360.0U/L的溶液，置于容器中，-20℃保存；3)配制100.0mmol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血浆乙醇检测试剂盒，其特征在于：包括磷酸盐缓冲液、氧化型辅酶I(NAD+)溶液、乙醇脱氢酶(ADH)溶液及丝网印刷电极。

【技术特征摘要】
1.一种血浆乙醇检测试剂盒，其特征在于：包括磷酸盐缓冲液、氧化型辅酶I(NAD+)溶液、乙醇脱氢酶(ADH)溶液及丝网印刷电极。2.根据权利要求1所述的血浆乙醇检测试剂盒，其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag/AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。3.根据权利要求1或2所述的血浆乙醇检测试剂盒，其中，所述ADH溶液的浓度为360.0U/L，所述NAD+溶液的浓度为100.0mmol/L。4.根据权利要求1或2所述的血浆乙醇检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液为220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸盐缓冲液。5.根据权利要求4所述的血浆乙醇检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液由220.0mmol/L磷酸钠溶液与磷酸氢二钠溶液配制。6.一种如权利要求1-6任意之一项所述的血浆乙醇检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：1)将待测血浆样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，涡旋混匀；2)分别取步骤1)得到的溶液、所述ADH溶液、所述NAD+溶液、所述磷酸盐缓冲液于Ep管中涡旋混匀，在室温下反应12min，得到反应混合液；3)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤2)得到的所述反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。7.根据权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁敏，史争虎，罗娟，张晓清，田刚，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50