一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其属于医学检测技术领域。其核心步骤是采用固体吸附剂特异性吸附血浆中的非极性生物基质，然后采用洗脱液对血浆中氨基酸类成分进行选择性洗脱进而获得内源性氨基酸组分。具体操作流程如下：血浆样品用一定比例的酸化水溶液稀释后，加样到特定的固体吸附剂中，通过优化洗脱溶剂的用量及配比等参数，实现了血浆中内源性氨基酸的选择性洗脱。所获内源性氨基酸组分浓缩后复溶，并在特定的色谱质谱条件下实现一次性多种内源性氨基酸的同步检测。该前处理方法具有操作简便可控、目标物回收率高、重现性好等特点，还避免了血浆中非极性物质对氨基酸定量检测的干扰，提高了检测灵敏度和准确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其属于医学检测
技术介绍
氨基酸代谢与许多遗传代谢病的发生有关联。在临床中评价血浆中氨基酸含量的变化对疾病的诊断和治疗具有重要的指导意义。目前血浆中氨基酸的检测前处理方法中，不管是衍生化法还是非衍生化法，液相色谱质谱分离检测时的氨基酸响应和峰型都会受到血浆中蛋白和脂质等众多强非极性生物基质的干扰。血浆样品中这些非极性物质的存在一方面在大批量进样时会造成仪器流路系统及色谱柱堵塞，另一方面在色谱柱上吸附的这些物质会有“携带效应”，造成氨基酸检测定量不准以及分析时间延长等未知问题。而基于血浆样品中常见氨基酸的前处理技术需要新的技术手段方法来满足临床中大批量的血浆样本分析。目前生物体内发现的氨基酸约180多种，这些内源性氨基酸的浓度含量差异很大，且有些含量较小氨基酸对人体健康却很重要。由于氨基酸其结构原因，检测相对困难，当前氨基酸的临床检测手段多数仅局限于参与蛋白合成的20种常见含量较大的自然氨基酸，实际上，不参与蛋白合成的氨基酸在疾病发生过程中也扮演着重要的角色。一个明显的例子就是，Sreekumar等人发现组织中高浓度肌氨酸与前列腺癌高度相关并具有增强癌组织侵袭性和促转移作用。【SreekumarA,PoissonLM,RajendiranTM,KhanAP,CaoQ,YuJetal.Metabolomicprofilesdelineatepotentialroleforsarcosineinprostatecancerprogression.Nature2009;457:910-914.】一次性实现体内更多内源性的氨基酸同时检测对临床的重要性不言而喻。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，原理是依靠固体吸附剂表面强非极性作用对血浆中非极性生物基质具有强烈的吸附作用。优化前处理过程中溶剂洗脱使用体积和配比等参数，血浆中的内源性氨基酸组分在固体吸附剂上随一定的洗脱液流出，强的非极性基质被保留，实现了对血浆中氨基酸的前处理制备。一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，包括以下核心方法步骤：1）血浆样品的预处理；2）固相吸附剂处理；3）氨基酸组分的选择性洗脱；4）浓缩复溶检测。（1）血浆样品的预处理血浆样品经一次离心后取上层血浆，将血浆与体积分数为5%的酸按体积比1:1混合；经涡旋、超声、二次离心后，取上清液，作为上样溶液；一次离心的离心力介于3000-5000g，二次离心的离心力介于13000-18000g；（2）固相吸附剂处理a)装填固体吸附剂小柱：将固体吸附剂装填于固相小柱中，规格为100mg的固体吸附剂装填1mL的小柱中；所述固体吸附剂上烷基基团为CnH2n+1，其中n=1，2，3，4，……，30，或者为这些基团中的两种或多种；固体吸附剂的粒径为5~100um，孔径为60~300nm，比表面积为50~800m2/g；b)固体吸附剂使用前采用有机溶剂活化，之后加入含有机溶剂和酸的水溶液进行平衡，所述平衡采用的平衡液为含有体积比为5%的有机溶剂和体积比为0.1%的酸的水溶液；活化和平衡过程采用的有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯、醋酸丁酯中的任意一种或多种组合；所采用的酸为甲酸、乙酸中的一种或两种组合；c)所有上样溶液上样于固体吸附剂中，完成非极性基质在吸附剂上完全吸附。（3）氨基酸组分的选择性洗脱固体吸附剂在上样全部酸化的血浆样品后，洗脱条件采用有机相∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1（体积比）进行洗脱，并收集所有的洗脱液，其中所采用有机相和酸与活化平衡所使用的有机相及酸需一致；（4）样品浓缩复溶检测收集到的洗脱液馏分浓缩至干后重溶于0.1moL/L的盐酸中，制成待测样品，适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法；衍生化检测方法：待测样品用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯衍生后，用液质联用的方法进行检测；液相色谱流动相条件包括A和B：A为含20mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液；流速为0.45mL/min，柱温45℃，色谱柱：XselectHSST32.1×100mm2.5um粒径色谱柱；非衍生化检测方法：待测样品直接用液质联用方法进行检测；液相色谱流动相包括A和B：A为含10mM甲酸铵、0.2%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1mM甲酸铵、0.2%甲酸的乙腈溶液；流速为0.40mL/min，柱温35℃，色谱柱为XAmide4.6×150mm5μm100A色谱柱。一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法具体操作流程为：1）血浆样品，在4℃下，5000g离心3min，取10-500uL的上层血浆与5%的酸水溶液1：1混合进行酸化。混合后样品涡旋30s，并超声3-5min。在4℃下，15000g高速离心3-10min，取所有上清液，作为上样溶液；2）加入3-5mL纯有机溶剂进行活化，之后再加入3-5mL特定比例的有机溶剂和酸的水溶液进行平衡。3）上样溶液全部加入固体吸附剂后，加入1mL特定的洗脱液进行洗脱，并收集所有的洗脱液馏分；4）馏分浓缩至干后重溶于100uL0.1moL/L的盐酸中，然后直接或衍生化后采用串联质谱进行检测。使用固体吸附剂选择性吸附血浆中非极性生物基质；血浆样品前处理方法所使用固体吸附剂为硅胶表面烷基键合材料；所使用固体吸附剂上的烷基基团为CnH2n+1(n=1，2，3，4，……,30)中的任意一种或两种或多种组合；所使用的固体吸附剂的粒径介于5~100um，孔径介于60~300nm，比表面积介于50~800m2/g；吸附方式为固体小柱的方式进行吸附，固体小柱规格为100mg/mL。固体吸附剂处理血浆样品体积介于10uL-500uL；固体吸附剂使用前采用纯有机溶剂进行活化，所采用的有机溶剂为：异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯、醋酸丁酯中的任意一种或多种组合；固体吸附剂并采用溶剂为体积比含5%的有机溶剂和0.1%的酸水进行平衡。平衡和活化采用的有机溶剂需一一对应，平衡采用的酸和血浆酸化采用的酸需一一对应；活化和平衡所使用的溶剂体积介于3-5mL；固体吸附剂在上样全部酸化的血浆样品后，洗脱条件采用有机相∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1（体积比）进行洗脱，所采用有机相和酸与活化平衡所使用的有机相及酸需一致。本申请的有益效果本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1）血浆样品的预处理血浆样品经一次离心后取上层血浆，将血浆与体积分数为5%的酸按体积比1:1混合；经涡旋、超声、二次离心后，取上清液，作为上样溶液；一次离心的离心力介于3000‑5000g，二次离心的离心力介于13000‑18000g；2）固相吸附剂处理将固体吸附剂装填于固相小柱中，规格为100 mg的固体吸附剂装填1mL的小柱；所述固体吸附剂为硅胶键合的C1‑30的烷基颗粒，固体吸附剂的粒径为5~100 um，孔径为60~300 nm，比表面积为50~800 m2/g；使用前采用有机溶剂活化，再加入含有机溶剂和酸的水溶液进行平衡，所述含有机溶剂和酸的水溶液为含有体积比为5%的有机溶剂和体积比为0.1%的酸的水溶液；3）氨基酸组分的选择性洗脱上样后采用酸化的有机溶剂水溶液为洗脱剂，酸化的有机溶剂水溶液中体积比为有机溶剂∶水∶酸=10‑30∶89.9‑69.9∶0.1；加入洗脱剂后收集所有的洗脱液馏分；4）样品浓缩复溶检测收集到的洗脱液馏分浓缩至干后重溶于0.1moL/L的盐酸中，制成待测样品，适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法。...
【技术特征摘要】
1.一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）血浆样品的预处理
血浆样品经一次离心后取上层血浆，将血浆与体积分数为5%的酸按体积比1:1混合；经
涡旋、超声、二次离心后，取上清液，作为上样溶液；一次离心的离心力介于3000-5000g，二
次离心的离心力介于13000-18000g；
2）固相吸附剂处理
将固体吸附剂装填于固相小柱中，规格为100mg的固体吸附剂装填1mL的小柱；所述固
体吸附剂为硅胶键合的C1-30的烷基颗粒，固体吸附剂的粒径为5~100um，孔径为60~300
nm，比表面积为50~800m2/g；使用前采用有机溶剂活化，再加入含有机溶剂和酸的水溶液
进行平衡，所述含有机溶剂和酸的水溶液为含有体积比为5%的有机溶剂和体积比为0.1%的
酸的水溶液；
3）氨基酸组分的选择性洗脱
上样后采用酸化的有机溶剂水溶液为洗脱剂，酸化的有机溶剂水溶液中体积比为有机
溶剂∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1；加入洗脱剂后收集所有的洗脱液馏分；
4）样品浓缩复溶检测
收集到的洗脱液馏分浓缩至干后重溶于0.1moL/L的盐酸中，制成待测样品，适用于采
用衍生化检测方法或非衍生化检测方法。
2.根据权利要求1所述的一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法应用于检
测氨基酸，其特征在于：所述待测样品适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法；
【专利技术属性】
技术研发人员：曹云峰，董军，郭志谋，葛广波，高鹏，梁鑫淼，房中则，孙晓宇，洪沫，范旭冉，
申请(专利权)人：辽宁润生康泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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